SH2B1β基因的克隆表達(dá)、單抗制備與鑒定.pdf

1、目前，肥胖迅速向全球蔓延，已經(jīng)波及到人們概念中該問題并不嚴(yán)重的東南亞地區(qū)。因此，肥胖已成為當(dāng)今全球醫(yī)學(xué)上越來越嚴(yán)重的問題。當(dāng)人們的體重大大超過推薦的指標(biāo)就可以確診為肥胖癥，隨著肥胖患病率的增高，與肥胖相關(guān)的其他慢性非傳染性疾病，如糖尿病、代謝綜合征、高血壓、心腦血管疾病、睡眠障礙、哮喘、腫瘤等的患病率也呈明顯上升的趨勢。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計，肥胖發(fā)生率的增加與成年人群死亡率的增加呈高度相關(guān)。近年來的研究表明，肥胖是由特定的生化因子引起的一系

2、列進(jìn)食調(diào)控和能量代謝紊亂而導(dǎo)致的疾病，與遺傳、環(huán)境、基因、膳食結(jié)構(gòu)有關(guān)，而基因是主要的決定因素。從宏觀的水平上看，食物攝入增加、體力活動減少和生熱機制的改變導(dǎo)致了脂肪的過多堆積；但從微觀水平上分析，成熟脂肪細(xì)胞的增多是脂質(zhì)發(fā)生累積的關(guān)鍵因素。肥胖已經(jīng)不僅僅是影響人體形象美觀的問題，還是威脅人類健康的問題。被列為世界上第六位的影響全人類疾病負(fù)擔(dān)的危險因素。 1950年，Ingalls等發(fā)現(xiàn)一個基因的陰性突變可以導(dǎo)致肥胖，他將該基因

3、稱為肥胖基因（obese gene，ob gene），第一次出現(xiàn)了ob基因的概念。Coleman等用交叉灌流實驗證明，某種血源性因子能調(diào)節(jié)動物攝食、代謝、參與肥胖形成，且這種因子的產(chǎn)生與ob基因有關(guān)。1991年Friedman描述了五種可以使小鼠形成肥胖的單基因突變，分別是obese（ob）、diabetes（db）、fat（fa）、tubby（tub）和obeseyellow（Ay），為研究肥胖的分子機制奠定了基礎(chǔ)。1994年Zhan

4、g等利用突變基因的定位克隆技術(shù)克隆了小鼠和人的ob基因，同時發(fā)現(xiàn)ob基因的突變可以導(dǎo)致肥胖，使肥胖研究真正進(jìn)入分子時代。 瘦素蛋白（Leptin）是ob基因的產(chǎn)物，是由白色脂肪細(xì)胞分泌的一種有167個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。它除了通過作用于下丘腦特異性受體發(fā)揮抑制飲食、減少能量攝入、減輕體重和增加能量消耗的作用外，同時還通過其它組織器官上的受體（胰島、肝臟、性腺、腎上腺、甲狀腺等）在體內(nèi)共同形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)作用系統(tǒng)，影響著機體

5、許多生理系統(tǒng)和代謝通路。瘦素蛋白的外周作用還包括調(diào)節(jié)糖代謝的平衡、促進(jìn)脂肪分解、抑制脂肪合成、參與免疫調(diào)節(jié)功能和促進(jìn)生長發(fā)育等。經(jīng)過長期的研究，人們對瘦素蛋白的生物學(xué)作用已經(jīng)有更進(jìn)一步的認(rèn)識：瘦素蛋白在能量代謝調(diào)節(jié)中并不是一個孤立的激素，而是與許多神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)、激素及其它因子協(xié)同發(fā)揮作用；在人群中存在有不可忽視的“瘦素抵抗”現(xiàn)象等。這些都是致力把瘦素蛋白單獨用作為治療肥胖癥藥物的研究者今后需要解決的問題。 隨著研究的深入，研

6、究者發(fā)現(xiàn)SH2B1β蛋白能與瘦素激活的細(xì)胞信號蛋白JAK2（非受體酪氨酸激酶）相互作用，調(diào)節(jié)能量代謝和體重。SH2B1β是SH2B信號接頭蛋白家族中的一員，其結(jié)構(gòu)上有SH2結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合磷酸化的酪氨酸殘基，進(jìn)而連接不同的信號蛋白，發(fā)揮其銜接信號及強化信號通路的作用。SH2B1β廣泛分布于下丘腦、肝臟、胰臟、脂肪組織等組織中，參與胰島素敏感性和血糖平衡的調(diào)節(jié)以及增強神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的神經(jīng)分化。由于SH2B1β是Leptin/JAK2信號

7、通路活化所必需的，如果敲除小鼠的SH2B1β基因，將使小鼠的體重是同窩正常組小鼠的兩倍，SH2B1β基因缺失導(dǎo)致嚴(yán)重的瘦素抵抗，食欲過盛和肥胖。SH2B1β通過自身結(jié)合JAK2同時募集胰島素底物蛋白（IRS）結(jié)合JAK2復(fù)合體，以JAK2/STAT3和IRS2/PI3K兩條路徑來增強瘦素依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因而SH2B1β是一種內(nèi)源的瘦素敏感性增強劑，同時，SH2B1β的過表達(dá)還可以抵消蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）介導(dǎo)的瘦素抑制信號的

8、作用。 目前有最新的文獻(xiàn)報道指出，脂肪組織與神經(jīng)組織中的SH2B1β在脂肪細(xì)胞的生長分化過程中產(chǎn)生兩種相反的效應(yīng)。雖然神經(jīng)組織SH2B1β的負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)占優(yōu)，但是脂肪組織SH2B1β是以一種細(xì)胞自主的方式來調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化，并在3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化過程中呈現(xiàn)表達(dá)量進(jìn)行性增加，同時促進(jìn)細(xì)胞中脂滴的累積以及脂肪分化轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C/EBPα的表達(dá)。 脂肪細(xì)胞數(shù)量的增多和體積的增大能導(dǎo)致肥胖，而前脂肪細(xì)胞分化的增

9、加則是導(dǎo)致成熟脂肪細(xì)胞數(shù)量增多的主要原因，近年來脂肪細(xì)胞的分化調(diào)控已成為肥胖及其相關(guān)疾病的研究熱點。人或動物的脂肪組織成份包括微血管、神經(jīng)組織、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及前脂肪細(xì)胞，脂肪細(xì)胞系的發(fā)育過程為多能干細(xì)胞-間充質(zhì)干細(xì)胞-前脂肪細(xì)胞-成熟脂肪細(xì)胞，所以有效的調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞的分化能控制脂肪組織增生、肥大。脂肪細(xì)胞分化與胰島素和胰島素樣生長因子相關(guān)，胰島素和胰島素樣生長因子通過結(jié)合其受體激活PI3K和MAPK兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)脂肪

10、細(xì)胞的分化。SH2B1β作為一種胰島素受體（IR）和胰島素樣生長因子受體（IGF-IR）活性的正調(diào)節(jié)蛋白，參與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的信號通路。 目前有關(guān)脂肪組織SH2B1β的研究很少，而且研究主要是針對鼠源蛋白。根據(jù)文獻(xiàn)報道.SH2B1β鼠源基因與人源基因的相似性達(dá)到85%-87%，本課題著眼于使用人源的SH2B1β基因在體外原核表達(dá)重組蛋白后，制備抗SH2B1β的單克隆抗體，通過定性及定量的方法初步探討該人源蛋白在人源前脂肪細(xì)胞分

11、化中的調(diào)控作用，為治療與前脂肪細(xì)胞分化關(guān)系密切的肥胖及其并發(fā)癥提供新的藥物靶點。 由于脂肪干細(xì)胞是臨界于間充質(zhì)干細(xì)胞與前脂肪細(xì)胞時期之間的一種細(xì)胞狀態(tài)，所以本研究通過體外原代培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞（ADSC）并誘導(dǎo)其成脂分化，收集分化成熟的脂肪細(xì)胞后，用TRIZOL一步法提取細(xì)胞總RNA。運用RT-PCR方法成功擴(kuò)增并克隆出.SH2B1β基因片段，將所得的目的基因克隆至pET28a（+）表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行了大量可溶性表達(dá)。用飽

12、和硫酸銨鹽析法和DEAE陰離子交換法純化重組蛋白，重組蛋白通過抗His-tag單抗鑒定后免疫小鼠制備單克隆抗體，分別用ELISA、Western-Blot法檢測及鑒定單克隆抗體的特異性。 利用RT-PCR技術(shù)成功克隆了SH2B1β基因，其大小約為2000bp。經(jīng)測序并與GenBank中序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示插入片段與已報道的SH2B1β基因序列配對一致，無移碼突變，大小為2016bp。將編碼基因克隆到pET-28a（+）原核表達(dá)

13、質(zhì)粒中，經(jīng)PCR、限制性酶切分析等鑒定，證實成功構(gòu)建了SH2B1β-pET28a（+）重組原核表達(dá)質(zhì)粒。 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組質(zhì)粒SH2B1β-pET28a（+）在大腸桿菌E.coli DE3中表達(dá)出His-tag融合重組蛋白，分子量約為80kDa，與理論值基本符合。表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性形式存在。經(jīng)過純化后，重組蛋白純度可達(dá)80%以上。用抗His-tag單抗對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-blot分析，可見特異性區(qū)帶出現(xiàn)，表明該

14、蛋白確實是所要表達(dá)的His-tag融合蛋白。進(jìn)一步用純化的表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠制備免疫血清，ELISA分析表明重組蛋白能與該免疫血清起反應(yīng)，而與正常小鼠血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，說明重組蛋白具有抗原活性。 將免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS-1融合后篩選到2株單抗分泌細(xì)胞。以純化重組蛋白為抗原，用ELISA法檢測單抗細(xì)胞株培養(yǎng)上清的效價，OD值分別為1.553～2.210。Western-blot結(jié)果顯示：抗SH2B1β的2株單抗與人源

15、脂肪組織內(nèi)提取的天然蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而陰性對照組則無明顯條帶出現(xiàn)，說明制備的單抗均為特異性單抗。 以上結(jié)果表明，我們已經(jīng)成功地構(gòu)建了SH2B1β-pET28a（+）原核重組表達(dá)質(zhì)粒，目前國內(nèi)尚未見關(guān)于SH2B1β重組并表達(dá)的相關(guān)報道。而且在大腸桿菌中大量表達(dá)出具有免疫活性的可溶性重組蛋白SH2B1β；篩選并建立了2株分泌抗SH2B1β單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究該蛋白的生物學(xué)功能、在脂肪細(xì)胞發(fā)育分化過程中所起的作用