蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)基因的鑒定、克隆與表達(dá).pdf

1、蘇云金芽孢桿菌由于其對(duì)人畜無(wú)害，得到了廣泛的應(yīng)用，篩選具有高殺蟲(chóng)活性的菌株具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。對(duì)其殺蟲(chóng)基因的鑒定能夠提供很好的基因資源，并且能夠提供一種應(yīng)對(duì)害蟲(chóng)抗性產(chǎn)生的方法。本研究采用PCR-RFLP鑒定體系，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室所保存的250株野生蘇云金芽孢桿菌進(jìn)行基因型的鑒定，并對(duì)新cry基因進(jìn)行克隆、異源表達(dá)和生物活性的研究，結(jié)果如下：
　　 1. 本文所采用的PCR-RFLP 鑒定體系對(duì)250 株野生Bt 菌株進(jìn)行基因型的鑒定

2、，發(fā)現(xiàn)含有cry1 、cry2 、cry3 、cry4/10 、cry8 、cry11 、cry30 、cry34/35 共8 類基因。其中38株含有cry1基因，35 株含有cry2基因，11 株含有cry3基因，8 株含有cry4/10基因，68 株含有cry8基因，4 株含有cry11基因，6 株含有cry30基因，5 株含有cry34/35基因。在基因組合方面，cry1+cry2 所占比例最大，為30 株，含有cry3+cry8

3、基因組合的有5 株，含有cry8+cry34/35，cry4/10+cry30，cry8+cry2基因組合的菌株各有一株。有134 株菌未鑒定出基因型，可能含有未知的基因型，需要借助其他的方法對(duì)其進(jìn)一步的研究。
　　 2. 所有菌株的對(duì)小菜蛾、棉鈴蟲(chóng)和華北大黑進(jìn)行活性分析測(cè)定，40株對(duì)小菜蛾有殺蟲(chóng)活性，4d校正死亡率達(dá)到100％；21株對(duì)棉鈴蟲(chóng)有殺蟲(chóng)活性，4d校正死亡率達(dá)到70％以上。
　　 經(jīng)基因鑒定其均含有cry1類

4、基因或cry2類基因。2株對(duì)華北大黑有殺蟲(chóng)活性，4d校正死亡率達(dá)到80％，經(jīng)基因鑒定其cry8G類基因。菌株HYW8活性分析可得，對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)小菜蛾、棉鈴蟲(chóng)的2d校正死亡率達(dá)到100％，具有較高的活性；對(duì)美國(guó)白蛾的LC50為0.74 g/ml，殺蟲(chóng)效果高于HD-1。
　　 3. 菌株SCC4和菌株JPL4中的cry基因經(jīng)PCR 鑒定未能確定其基因型，對(duì)其進(jìn)行克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)：菌株SCC4 經(jīng)克隆得到的897bp的部分基因的序列，通過(guò)

5、NCBI分析可得，與GenBank中已知的Bt基因cry8B delta-toxin-like gene（GenBank：FJ770571.1）的序列相似性最高，為91％；菌株JPL4 經(jīng)克隆得到的1362bp的部分基因的序列，通過(guò)NCBIBlast分析可得，與GenBank中已知的Bt基因相比較，未發(fā)現(xiàn)與其相似程度高的基因序列，推測(cè)其含有新的cry基因，有待進(jìn)一步研究。
　　 4.菌株HYW8 晶體蛋白分析，表明該菌株表達(dá)13

6、0kDa 左右的晶體蛋白。經(jīng)基因型鑒定其含有cry1Ab和cry1E基因和一種新cry2基因，推斷130kDa 左右的晶體蛋白為cry1 類基因表達(dá)，cry2 類基因在菌株中不表達(dá)，為沉默基因。
　　 5. 從菌株HYW8中克隆了新cry2A基因，對(duì)cry2A基因序列測(cè)序結(jié)果表明，該基因編碼區(qū)為1896bp，應(yīng)用BLAST 軟件進(jìn)行同源性比較顯示該蛋白與cry2Ah2基因（登錄號(hào)為FJ550343）編碼蛋白的同源性最高為98％，

7、由Bt基因國(guó)際命名委員會(huì)命名為cry2Ah3。
　　 6. 從菌株FBG1的總DNA中克隆得到全長(zhǎng)cry32基因，該基因編碼區(qū)為3711bp，與cry32Aa1基因（登錄號(hào)為AAG36711）的同源性最高為99％，提交GenBank 注冊(cè)，登錄號(hào)為GU063849，并由Bt基因國(guó)際命名委員會(huì)命名為cry32Aa2，為第四等級(jí)的新基因，在國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)。對(duì)其進(jìn)行異源表達(dá)分析，在50mM IPTG，18℃，150rpm 誘導(dǎo)條件下，在