半滑舌鰨性腺差異表達(dá)基因的克隆鑒定與表達(dá)分析.pdf

1、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是一個優(yōu)良的高效海水養(yǎng)殖品種。但半滑舌鰨雌、雄個體差異巨大，并且雄性個體生殖能力弱，因而導(dǎo)致繁殖能力差。因此開展性別調(diào)控，提高受精效率為主的繁殖生物學(xué)研究對于提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖效率，增加養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，都有重要意義。近幾年來，有關(guān)半滑舌鰨繁殖生物學(xué)的研究已全面展開，但僅限于組織學(xué)和胚胎學(xué)的研究，在基因水平上研究還未見報(bào)到，因此研究半滑舌鰨雌雄性腺的差異表達(dá)基因譜不僅對于研究造成

2、其雌、雄發(fā)育差異的機(jī)制，研究魚類性別決定和分化的過程有著重要的理論意義而且有利于探索半滑舌鰨性別調(diào)控以及提高受精效率的新方法。本文采用SSH的方法，建立了半滑舌鰨成體魚卵巢與精巢的差減cDNA文庫，通過篩選鑒定與測序獲得了41個性腺差異表達(dá)的非重復(fù)克隆，進(jìn)而通過RACE技術(shù)克隆了其中5個基因，并對其進(jìn)行了序列特征和時(shí)空表達(dá)分析。此外還通過同源克隆的方法克隆了在精巢中特異表達(dá)的DMRTI基因，并對其進(jìn)行了組織表達(dá)分析。 以成體半滑

3、舌鰨卵巢作為檢測子(tester)，成體魚的精巢作為驅(qū)趕子(driver)，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。經(jīng)兩輪差減雜交，兩輪抑制性PCR擴(kuò)增后，取差減的PCR產(chǎn)物與T載體連接，構(gòu)建抑制差減cDNA文庫，隨機(jī)挑取2000余個克隆，對其中1000多個克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，發(fā)現(xiàn)近600個克隆中均含有插入片段，大小在250-2000bp之間，進(jìn)一步對含有插入片段的近600個克隆進(jìn)行了斑點(diǎn)雜交篩選，得到196個性腺差異表達(dá)的陽性克

4、隆，經(jīng)測序共獲得166陽性克隆的結(jié)果，共41個非重復(fù)的克隆，其中已知基因20個未知基因21個。 利用RACE技術(shù)成功克隆到了半滑舌鰨的zp3α、Aquaporinlo、survivin、PABP和RacGAP1這5個與生殖相關(guān)的基因，這些基因在半滑舌鰨中都是首次被克隆鑒別。ZP3蛋白是卵膜的組成成分之一，其在卵子形成和受精中起到重要作用。在差減文庫中篩選并克隆了—ZP3亞家族的成員，命名為zp3α，該亞家族中的另外一成員在本實(shí)驗(yàn)

5、構(gòu)建的全長cDNA文庫中獲得，命名為zp3b。兩者的cDNA全長分別為1638bp和1135bp，開放閱讀框分別編碼518和312個氨基酸的蛋白質(zhì)。序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析均表明兩者屬于ZP3亞家族。RT-PCR分析表明，二者在卵巢中大量表達(dá)，同時(shí)也在其它一些雌性的組織中有低量表達(dá)，有意思的是zp3bmRNA也在精巢和雄性的腎臟中被檢測到。Aquaporinlo主要在卵巢中表達(dá)，與海水魚類卵子成熟吸水排卵有關(guān)。在差減cDNA文庫中克隆了半

6、滑舌鰨的Aquaporinlo基因，同時(shí)通過同源克隆的方法克隆了非卵巢特異表達(dá)的Aquaporinl基因，二者的cDNA全長分別為993bp和1335bp，開放閱讀框分別編碼262和261個氨基酸的蛋白質(zhì)。RT-PCR分析表明Aquaporinlo僅在卵巢中大量表達(dá)在雌性的腎臟中微量表達(dá)，Aquaporinl在雌性和雄性的多種組織中均有表達(dá)。Survivin是一種細(xì)胞凋亡抑制因子，其在卵子形成和胚胎發(fā)育中具有重要作用?？寺×税牖圉嵉膕

7、urvivin基因，序列分析表明該基因cDNA全長704bp，開放閱讀框編碼147個氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白包含一個BIR結(jié)構(gòu)域。RT-PCR分析表明該基因主要在卵巢中表達(dá)，隨著胚胎發(fā)育表達(dá)逐漸減少，這可能表明該基因在半滑舌鰨卵子形成和早期胚胎發(fā)育中起到重要作用。ePABP是特異的在卵巢和早期胚胎表達(dá)的Poly(A)結(jié)合蛋白。從差減文庫中克隆了-PABP因，序列分析及RT-PCR分析組織及胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，初步認(rèn)為該基因可能為與其它物種

8、的ePABP2因同源。RacGAP1是小G蛋白Rac重要的調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，細(xì)胞移動，細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞凋亡方面起重要作用。從差減文庫中克隆了一主要在卵巢中表達(dá)的RacGAP1基因，這是第一次發(fā)現(xiàn)主要在卵巢中表達(dá)的RacGAP1基因，組織表達(dá)及胚胎發(fā)育的表達(dá)分析，可能暗示該基因在卵子形成和胚胎發(fā)育中起重要作用。 利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鰨的DMRT1基因，該基因cDNA序列全長1232bp，編碼258個氨基酸的蛋