PPARγ激動劑體外篩選模型的建立及其應(yīng)用.pdf

1、背景
　　2型糖尿病是由多種因素引起的機體組織對胰島素敏感性降低而導(dǎo)致的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。隨著生活水平的提高，在營養(yǎng)過剩、久坐少動時間增加及工作壓力過大的交叉影響下，糖尿病的發(fā)生率在快速攀升。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)公布的數(shù)據(jù)，目前全球有3.71億糖尿病患者，而中國糖尿病患者人數(shù)已超過9200萬，其中90％以上的糖尿病屬于2型糖尿病。糖尿病已成為繼腫瘤和心腦血管疾病之后威脅我國國民健康的第三大疾病。
　　過氧化物酶體增殖物

2、激活受體γ(peroxisome proliferator-activatedreceptorγ，PPARγ)是一種配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。噻唑烷二酮類（Thiazolidinediones，TZDs）藥物，如羅格列酮，是PPARγ的激動劑，能夠改善胰島素抵抗，主要用于治療2型糖尿病。
　　基于細(xì)胞水平轉(zhuǎn)錄實驗，PPARγ激動劑可分為完全激動劑和部分激動劑。羅格列酮通常被看作是PPARγ完全激動

3、劑。與PPARγ完全激動劑相比PPARγ部分激動劑具有相似的胰島素增敏作用，并且副作用更少，具有更好的安全性。因此有必要去尋找新的安全有效的PPARγ部分激動劑。
　　方法:用LipofectamineTM2000將含有PPARγ基因質(zhì)粒(pIRES-PPARγ)、螢火蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pPPRE×3-TK-Luciferase）以及內(nèi)參照質(zhì)粒(pRL-TK)按不同比例共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，并對三種質(zhì)粒比例進行優(yōu)化;用不

4、同配體處理轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，通過檢測熒光素酶相對活性以確定加入配體對PPARγ的激動效應(yīng);采用經(jīng)典的PPARγ激動劑和PPARγ特異性拮抗劑，其他核受體激動劑以及PPARα激動劑考察不同化合物對PPARγ的激動程度，確定模型的特異性;以Z'值考察模型重復(fù)性;并觀察了PPARγ激動劑的作用時間特點。
　　在篩選的候選化合物中，化合物CMHX(00)8有較好的PPARγ激動活性;3T3-L1細(xì)胞按常規(guī)誘導(dǎo)分化，在分化第2

5、天加入CMHX(00)8和羅格列酮，在分化第7天分別進行油紅O染色，形態(tài)學(xué)上觀察細(xì)胞分化程度;在490nm波長下檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量，考察細(xì)胞脂質(zhì)合成能力;Q-PCR和ELISA方法進一步研究CMHX(00)8對脂聯(lián)素和aP2表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:PPARγ質(zhì)粒、報告基因質(zhì)粒以及內(nèi)參照質(zhì)粒比例為2∶6∶1時相對熒光素酶活性最高;PPARγ激動劑羅格列酮可顯著增加相對熒光素酶的活性而GW9662可抑制這種作用，且相對熒光

6、素酶的活性隨著處理時間的增加而升高;地塞米松，全反式維甲酸，雌二醇和非諾貝特?zé)o上述活性;根據(jù)9次重復(fù)實驗結(jié)果計算Z'值為0.70。CMHX(00)8能夠增加PPARγ的活性，但作用強度低于羅格列酮;油紅O染色和TG含量結(jié)果表明CMHX(00)8能夠促進3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積，但程度均較羅格列酮弱; Q-PCR和ELISA結(jié)果顯示CMHX(00)8具有類似羅格列酮增加脂聯(lián)素表達(dá)和分泌的能力，但對aP2表達(dá)的促進作用要顯著低于