PPARγ激動劑羅格列酮保護腎臟纖維化的實驗研究.pdf

1、第一部分 目的：研究過氧化物酶體增值體激活受體(PPAR)γ激動劑羅格列酮(Rosiglitazone，RGZ)抑制轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導人近端腎小管上皮細胞(HKC)轉分化的作用，探討羅格列酮治療腎臟病的機理。 方法：以HKC細胞為研究對象，采用免疫印跡檢測纖維連接蛋白(FN)表達的水平以評價細胞外基質合成的變化，以α-SMA為HKC激活的標志物。采用免疫熒光對FN的表達進行定位，以明膠酶譜分析法(gel

2、atinzymography)檢測細胞上清中基質金屬蛋白酶(MMP)表達量的變化。 結果：實驗結果表明TGF-β1具有促進HKC細胞表達α-SMA的作用，并可以促進FN合成，羅格列酮能夠抑制TGF-β1所誘導的HKC細胞α-SMA和FN合成，此作用呈明顯的劑量依賴性，和人工合成PPARγ特異性激動劑GW1929作用相似。并且羅格列酮單獨作用于HKC時，也有降低HKC細胞FN合成的作用。TGF-β1有促進HKC培養(yǎng)上清夜中MMP-

3、2表達的作用，此作用呈明顯的時效依賴性，不能為羅格列酮所阻滯。 結論：羅格列酮能夠阻止TGF-β1誘導的人近端小管上皮細胞細胞轉分化與細胞外基質的表達與合成，和人工合成PPARγ特異性激動劑GWl929作用相似。第二部分 目的：通過觀察羅格列酮抑制單側輸尿管結扎(UUO)小鼠病變腎組織纖維化的作用，探討羅格列酮治療腎臟病的作用機制。 方法：采用左側輸尿管結扎的方法建立單側輸尿管梗阻(UUO)雄性CD-1

4、小鼠動物模型，術后小鼠隨機分為3組：Sham，UUO，UUO+羅格列酮(7.2mg/kg/d)治療組。實驗設兩個時間點：3天，6天。以α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)做為上皮細胞轉分化的觀察指標。以纖維連接蛋白(FN)為間質纖維化的指標，以蛋白印跡技術(Western blotting)檢測α-SMA、FN的表達，以免疫熒光及蘇木素-伊紅(HE)染色檢測組織中纖維化指標的表達及觀察腎組織病變程度。 結果：單側輸尿管結扎可以使小鼠

5、腎組織產(chǎn)生間質纖維化，并且梗阻腎FN和α-SMA的表達增加，呈明顯的時效性，羅格列酮可以減輕UUO小鼠腎臟間質病變，降低FN和α-SMA的表達水平，抑制上皮細胞轉分化。 結論：羅格列酮可以改善UUO小鼠腎臟的纖維化，其作用可能與減少間質纖維連接蛋白的表達和抑制上皮細胞轉分化有關。第三部分 目的：觀察高糖誘導腎小管上皮細胞表達纖維連接蛋白(FN)與整合素聯(lián)接激酶(ILK)的關系，探討糖尿病腎病小管間質纖維化的發(fā)病

6、機制。 方法：以人腎小管上皮細胞株HKC細胞和鏈脲佐菌素(STZ)誘導的CD-1小鼠糖尿病動物模型為研究對象，采用蛋白印跡的方法檢測細胞或腎組織ILK和FN蛋白的表達。通過基因轉染的方法，將含無激酶活力的人ILK基因表達質粒pcMV-kdILK轉染HKc細胞，觀察抑制ILK活力對高糖誘導的HKC合成FN的影響。 結果：動物實驗結果表明，STZ注射4周CD-1小鼠血糖水平顯著高于對照組(20.3±2.7 vs 6.1±1.

7、4 mmol/L)，同時，腎組織ILK和FN的表達量亦顯著高于對照組，分析結果表明二者之間存在明顯的相關性(P<0.01)。細胞培養(yǎng)研究證實，高糖能夠刺激HKC上調ILK和FN蛋白的表達，并且呈時間和劑量依賴性。HKC細胞轉染pCMV-kdILK質粒以抑制ILK的活力，能夠顯著地拮抗高糖刺激HKC表達FN的作用。 結論：高糖能夠通過上調ILK蛋白造成腎小管表達并合成FN，抑制ILK能夠拮抗高糖刺激HKC合成FN的作用。說明ILK