蛋白質芯片技術對大鼠角膜移植免疫排斥反應相關蛋白質群的分析.pdf

1、研究背景： 移植排斥是角膜移植術失敗的主要原因，尤其是植床上有大量新生血管的高危角膜移植患者，移植后排斥反應發(fā)生早且嚴重，移植物常被破壞。在局部或全身應用免疫抑制劑的情況下，角膜植片的存活率仍小于35％，這已成為目前亟待解決的問題。該反應是一多因素參與的復雜過程，影響因素具有廣泛性和交叉性. 蛋白質組是一個基因組所能編碼的所有蛋白的組合。蛋白質組學是對一個基因組、一種生物、一種細胞、組織所表達的全部蛋白質及其相互作用的研

2、究，提供的資料更真實地反映基因、組織、器官的實際功能狀態(tài)。 蛋白質芯片-飛行時間質譜技術(SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization-TimeofFlightMassSpectrometry，SELDI-TOF-MS)是蛋白芯片與表面加強激光解吸電離飛行質譜的技術組合。優(yōu)越性主要表現(xiàn)在：可直接用未經純化的樣品進行分析；樣品需求量少；靈敏度高；高通量。 與角膜相關的蛋白質組研究在國際

3、上處于起步階段。淚液中很多蛋白質成分為外分泌蛋白，受眼局部因素及全身狀態(tài)的雙重影響。在一些眼病或者全身疾病的研究中，已發(fā)現(xiàn)淚液有特征性的蛋白質成分變化.淚液中的低豐度蛋白有相當部分具有重要的生理和病理意義。有研究表明：角膜移植術后，淚液中的IgG、sIgA、LF呈一規(guī)律變化曲線.當捧斥反應發(fā)生時，IgG水平異常升高，LF水平呈下降趨勢。檢測淚液中的IG含量，有助于預防角膜移植排斥反應的發(fā)生和監(jiān)測排斥反應是否治愈。還有研究表明急性排斥期房

4、水白蛋白、H型細胞角蛋白和α-1抗胰蛋白酶成分明顯升高，提示排斥期房水蛋白成分變化至少有三種機制：房水-血屏障的破壞、酶性降解和局部合成的蛋白釋放入房水。但是，對于血清中蛋白質組的改變及與血清與角膜移植排斥反應的相關分析及研究尚未見報道。 研究目的： 1.在原有動物模型基礎上，改進大鼠角膜移植模型建立技術技巧，并以此為基礎，從組織形態(tài)學方面驗證并探討角膜移植術后免疫排斥反應的發(fā)病機制； 2.利用SELDI蛋白芯片

5、技術檢測發(fā)生與未發(fā)生角膜移植排斥反應的大鼠淚液、房水以及血清的標志蛋白表達；對照分析蛋白成分變化機制，建立診斷模型，并驗證模型的特異性與敏感性；篩選角膜移植捧斥反應相關蛋白并分析其與角膜免疫排斥反應相關的可能機制。 研究方法： 1.建立大鼠同種異體穿透性角膜移植模型，Wistar大鼠20只為供體，SD大鼠40只為受體，行SD大鼠右眼同種異體穿透性角膜移植，術中，Ⅰ組從角膜旁中心取植片，縫線保留長度約1mm，Ⅱ組取角膜中心

6、植片，縫線盡量剪短； 2.術后大鼠隨機分為2組，每組20只。分別為Ⅰ組排斥組(生理鹽水對照組)，Ⅱ組非排斥組(CsA滴眼液、典比殊滴眼液點眼).術后第1天開始起在裂隙燈顯微鏡下進行臨床觀察，對角膜混濁、水腫、新生血管三項指標進行評分.所得數(shù)據(jù)以means±SD表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行處理。統(tǒng)計方法：獨立樣本t檢驗(Independent-SampleTTest)，P<0.05有統(tǒng)計學意義； 3.兩組均于術

7、后第7天隨機取2只大鼠角膜，HE染色及常規(guī)透射電鏡觀察； 4.同時采集其他大鼠血液、淚液、房水.取血后血液在冰上靜置1h.0℃離心5000r／min10min。分離血清，與淚液、房水一并凍存于-80℃以備后用。 5.將每組18例淚液、房水標本及16例血清標本(每組有2例血清標本發(fā)生凍融，放棄)隨機分為2組。取其中一組用于蛋白質決策樹模型的建立：應用WCX2蛋白芯片捕獲蛋白，蛋白質離子化后，用PBSIIC型蛋白質芯片閱讀機

8、對不同組淚液、房水及血清蛋白進行檢測，獲得各樣本的蛋白指紋圖譜。采用CiphergcnBiosystems公司的CiphergenProteinChip3.0版本機帶分析軟件自動采集數(shù)據(jù)，采用BiomarkerWizard軟件對芯片檢測得到的蛋白質以基于最小Gini指標方法建立決策樹模型，然后以10折交叉驗證法(10-foldCross-validationEstimates)進行決策樹評估，找出區(qū)分兩組樣本能力最強的蛋白質組合；

9、 6.用另外一組標本盲法檢測該模型的敏感性及特異性； 7.在Swiss-Prot和TrEMBL蛋白質庫中對標志蛋白進行初步篩選。 結果: 1.2組大鼠術后角膜轉歸情況都按預期發(fā)展，標本采集過程對大鼠角膜及全身情況沒有影響； 2.根據(jù)大鼠同種異體穿透性角膜移植術后評分，確定在術后第7天時Ⅰ組排斥組大鼠已經發(fā)生角膜移植排斥反應，而Ⅱ組未排斥組大鼠沒有發(fā)生角膜移植排斥反應; 3.HE染色發(fā)現(xiàn)角膜植片上

10、皮基底細胞形成很多空泡，間質結構疏松，大量炎性細胞浸潤，主要存在于上皮層和淺層基質。基質層可見新生血管官腔； 4.透射電鏡發(fā)現(xiàn)排斥反應發(fā)生的角膜上皮層層次紊亂，表層細胞微絨毛消失，細胞超微結構不明顯，細胞間橋粒纖維化，含豐富糖原顆粒；固有層膠原微纖維平行排列規(guī)律性消失，細胞核濃縮，染色質邊集，核膜不清，部分消失，周圍超微結構不清，殘留內質網擴張及豐富糖原堆積，固有層膠原角化，可見脂滴； 5.在分子量1000-20000D

11、a范圍內： 5.1淚液 5.1.1淚液排斥與非排斥組中共有108個蛋白質被標記，其中有分類價值的標志蛋白質有11種，相對分類價值較高的有6種，其中M2167.66、M3356.53在排斥反應組中表達下調，M1169.86、M1183.69、M9238.59、M11882.2在捧斥反應組中表達上調； 5.1.2盲法檢測結果，該決策樹模型敏感性為78％，特異性為89％； 5.1.3蛋白質搜庫結果提示相關蛋白可

12、能是下調蛋白：Pro-histogranin、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)；上調蛋白：β-防御素2、細胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)亞基、神經激肽A(NKA); 5.2房水 5.2.1房水排斥與非排斥組中共有87個蛋白質被標記，其中相對分類價值較高的蛋白質有6種。分別為M1037.98，M1436.29，M1326.12，M1082.37，M1067.86，M11261.6并且在排斥反應組中表達上調；

13、5.2.2盲法檢測結果：該決策樹模型敏感性為67％，特異性為78％； 5.2.3蛋白質搜庫結果提示相關蛋白可能是血管緊張素-1(AGT-I)、血管緊張素-2(AGT-II)、神經肽、轉化生長因子TGF-β； 5.3血清 5.3.1血清排斥與非排斥組中共有58個蛋白質被標記，其中相對分類價值較高的蛋白質有6種，分別為M8809.89，M7010.01，M4420.15，M3507.18，M4151.08，M1706

14、.30并且在排斥反應組中表達上調； 5.3.2盲法檢測結果：該決策樹模型敏感性為75％，特異性為75％； 5.3.3蛋白質搜庫結果提示相關蛋白可能是神經肽Y，β-抵抗素、高血糖素Cortistatin(CST)。 結論： 1.通過對建立大鼠穿透性角膜移植動物模型技術的改進以及標本采集方法的探討，整理出一套行之有效的建立模型以及標本采集的操作規(guī)程；保留縫線和鉆取植片部位等方法可以影響角膜移植術后的轉歸；

15、 2.術后第7天是大鼠角膜術后發(fā)生移植排斥組與未發(fā)生排斥組的分界點。是術后取材的時間點； 3.大鼠角膜移植術后臨床觀察表現(xiàn)評估與HE染色組織形態(tài)學觀察結果相符； 4.透射電鏡結果表明已發(fā)生排斥反應的角膜植片超微結構特征表現(xiàn)為細胞凋亡和細胞壞死共存。由此我們推斷，細胞凋亡的確參與了角膜移植急性排斥反應的發(fā)生；. 5.應用SELDI-TOF-MS技術獲得大鼠角膜移植后淚液、房水、血清標志蛋白表達圖譜的實驗方法穩(wěn)定

16、可行，檢測出的淚液、房水、血清中的生物標記物可正確區(qū)分捧斥與非排斥組大鼠； 6.Pro-histogranin可能通過轉化為histogranin，β-防御素通過參與直接及間接的免疫激活作用，CST通過刺激單核細胞的分化和激活參與角膜移植術后免疫排斥反應； 7.我們的試驗結果表明在淚液、房水、血清的標志蛋白表達中均有神經肽的上調表達.這提示我們在角膜的免疫捧斥反應的后續(xù)研究中考慮神經遞質是否通過刺激單核細胞的分化和激活參