海芒果種子提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、肝癌有原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌之分，原發(fā)性肝癌為我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，也是我國(guó)惡性腫瘤防治研究的重點(diǎn)。死亡率在惡性腫瘤中居第三位，僅次于胃癌和食管癌。手術(shù)切除是目前治療早期肝癌唯一有效的方法，但大多數(shù)患者就診時(shí)已達(dá)病程中晚期，手術(shù)療效受限，因而尋找新的治療方法尤為重要。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的深入研究，探討誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的方法成為提高臨床療效的新思路。強(qiáng)心苷是一類(lèi)對(duì)心肌有興奮作用、具有強(qiáng)心生理活性的甾體化合物，能選擇性地作用于

2、心肌，加強(qiáng)心肌收縮力，臨床上用于治療充血性心力衰竭及某些心律失常。然而，這類(lèi)化合物在預(yù)防和治療腫瘤方面正扮演著越來(lái)越重要的角色。在過(guò)去五年內(nèi)，許多研究已經(jīng)表明強(qiáng)心營(yíng)對(duì)惡性細(xì)胞具有優(yōu)先選擇性殺傷作用，而不影響正常細(xì)胞的增殖。因此，強(qiáng)心苷有望成為一種靶向治療腫瘤的新型抗腫瘤藥物。海芒果全株有毒，其中果仁的毒性最大，其毒性在于海芒果毒素，其分子結(jié)構(gòu)與異羥洋地黃毒甙(一種強(qiáng)心劑)非常相似，會(huì)阻斷鈣離子在心肌中的傳輸通道，造成中毒者迅速死亡。顯然

3、，了解海芒果毒素的毒理、藥理及其影響因素對(duì)開(kāi)發(fā)海芒果有重要意義。同時(shí)，海芒果在醫(yī)藥方面也有開(kāi)發(fā)價(jià)值。海芒果中含有多種強(qiáng)心苷類(lèi)化合物，均為甲型強(qiáng)心苷。海芒果植株還含具有抗皮膚癌、乳腺癌和肺癌活性的強(qiáng)心苷。Laphookhieo等從白花海芒果種子中成功分離出一系列具有抗癌活性的強(qiáng)心苷類(lèi)化合物。β-D-glucosyl-(14)-α-L-thevetosides of17β-digitoxigenin(GHSC-73)和2'-eoi-2'-O

4、-Acetylthevetin B(GHSC-74)是從植物海芒果種子中提取的兩種具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，屬?gòu)?qiáng)心苷。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未曾報(bào)道過(guò)這兩種化合物的抗腫瘤活性。而HepG2細(xì)胞來(lái)源于人肝癌組織，與正常肝細(xì)胞在細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)上具有同源性，因此本論文選取人肝癌細(xì)胞株HepG2作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，來(lái)研究GHSC-73和GHSC-74對(duì)其增殖，周期和凋亡的影響及其作用機(jī)制。 第一部分β-D-glucosyl-(1-4)-α-L-theve

5、tosides of17β-digitoxigenin(GHSC-73)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響及其作用機(jī)制 目的： 研究β-D-glucosyl-(1-4)-α-L-thevetosides of17β-digitoxigenin(GHSC-73)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖，周期和凋亡的影響及其作用機(jī)制。 方法： 采用MTT法檢測(cè)GHSC-73對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2，人張氏肝細(xì)胞C

6、hangliver和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株3T3-Swiss albino增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀Propidium Iodide(PI)單標(biāo)法檢測(cè)GHSC-73對(duì)HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程的影響；Real-time PCR檢測(cè)S期相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化；采用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法和P1單標(biāo)的sub-G1(細(xì)胞亞二倍體凋亡峰)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用Hoechst33342和DAPI熒光染色法觀察GHSC-73

7、處理后細(xì)胞形態(tài)的變化；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA梯狀條帶；western blotting檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kapperB，NF-κB)亞基p65蛋白表達(dá)水平；采用流式細(xì)胞儀JC-1染色法檢測(cè)線粒體膜電位(△ψm)水平；免疫熒光染色檢測(cè)AIF和NF-κB亞基p65的核移位；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光探針DCFH-DA標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)

8、活性氧(reactive oxygen species，ROS)；利用caspase-3和caspase-8活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)caspase-3和caspase-8酶活性；采用流式細(xì)胞儀異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的anti-human Fas抗體和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的anti-human FasL抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fas和FasL的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論： GHSC-73可選擇性的控制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖，但是

9、不影響人張氏肝細(xì)胞Chang liver和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株3T3-Swiss albino的增殖。GHSC-73可通過(guò)S期阻滯和細(xì)胞凋亡來(lái)抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并且通過(guò)Caspase非依賴的凋亡誘導(dǎo)因子介導(dǎo)的線粒體通路和抑制NF-κB活性來(lái)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，但是凋亡過(guò)程并不依賴活性氧的產(chǎn)生和Fas/FasL的相互作用。GHSC-73具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并能使細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生變化。 第二部分2'-epi-2'

10、-O-Acetylthevetin B(GHSC-74)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響及其作用機(jī)制 目的：研究2'-epi-2'-O-Acetylthevetin B(GHSC-74)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響及其作用機(jī)制。 方法：采用MTT法檢測(cè)GHSC-74對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2，人張氏肝細(xì)胞Changliver和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株3T3-Swiss albino增殖的影響；采用流

11、式細(xì)胞儀Propidium Iodide(PI)單標(biāo)法檢測(cè)GHSC-74對(duì)HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程的影響；利用Giemsa染色檢測(cè)細(xì)胞分裂指數(shù)(Mitotic Index，MI)；采用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法和PI單標(biāo)的sub-G1(細(xì)胞亞二倍體凋亡峰)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用Hoechst33342和DAPI熒光染色法觀察GHSC-74處理后細(xì)胞形態(tài)的變化；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA梯狀條帶；western

12、blotting檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)，CDC2，Cyclin B1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平；采用流式細(xì)胞儀JC-1染色法檢測(cè)線粒體膜電位(Δψm)水平；免疫熒光染色檢測(cè)AIF；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光探針DCFH-DA標(biāo)汜的細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species．ROS)；采用流式細(xì)胞儀異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的anti-human Fas抗體和藻紅蛋白

13、(PE)標(biāo)記的anti-human FasL抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fas和FasL的蛋白表達(dá)水平；采用流式細(xì)胞儀熒光探針Fluo-3 AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。 結(jié)論： GHSC-74可選擇性的控制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖，但是不影響人張氏肝細(xì)胞Chang liver和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株3T3-Swiss albino的增殖。GHSC-74可通過(guò)S和G2期阻滯和細(xì)胞凋亡來(lái)抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并且通過(guò)Caspase非依賴的