腫瘤相關巨噬細胞在子宮內(nèi)膜癌雌激素敏感性中的作用及機制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌(Endometrial carcinoma，EC)是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中70％-80％為Ⅰ型子宮內(nèi)膜樣腺癌，普遍認為其發(fā)生與長期無孕激素拮抗的雌激素刺激相關。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及其癌前病變患者血清雌激素水平并不高于健康同齡婦女，提示可能存在其他機制參與Ⅰ型內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。
　　對其他實體腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥刺激在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。大量流行病學研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌與胰島素

2、抵抗密切相關，而慢性炎癥是后者的重要臨床表現(xiàn)之一。也有研究顯示，作為慢性炎癥的具體表現(xiàn)形式，在子宮內(nèi)膜癌病灶存在巨噬細胞浸潤，后者與子宮內(nèi)膜癌的不良預后密切相關。提示巨噬細胞浸潤可能在Ⅰ型內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但其作用和機制還有待進一步研究。
　　人體內(nèi)的單核/巨噬細胞可被誘導活化為不同表型:M1型和M2型，目前，M2型巨噬細胞被認為是在多數(shù)腫瘤中浸潤的巨噬細胞，也被稱為腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated

3、macrophages，TAMs)。以TAMs浸潤為主的炎癥反應與多種腫瘤的預后不良有關。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞浸潤可調(diào)控腫瘤細胞激素受體的表達。在前列腺癌，巨噬細胞浸潤可上調(diào)雄激素受體表達，促進雄激素對前列腺的致癌作用。在乳腺癌，肥胖造成的慢性炎癥狀態(tài)可激活乳腺癌局部的雌激素受體。
　　因此，我們推測子宮內(nèi)膜病灶局部TAMs浸潤可能通過調(diào)控雌激素受體，增加內(nèi)膜局部對雌激素的敏感性，促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展。
　　本研究擬通過分析巨

4、噬細胞浸潤與子宮內(nèi)膜癌和癌前病變的相關性，以及巨噬細胞對子宮內(nèi)膜癌雌激素受體的調(diào)控及其對雌激素的敏感性，驗證上述假設，并進一步分析可能的機制所在。具體分為四部分:第一部分:Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及內(nèi)膜增生性病變患者血清雌激素水平分析;第二部分:巨噬細胞浸潤與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及內(nèi)膜增生性病變的相關性分析;第三部分:TAMs通過ERα調(diào)控Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細胞雌激素敏感性;第四部分:TAMs通過IL-17調(diào)控Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細胞ERα表達。
　　第一

5、部分:Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及癌前病變患者血清雌激素水平分析
　　目的:檢測血清雌激素水平與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的相關性。
　　方法:1.收集2011年9月至2013年12月，子宮內(nèi)膜正常及發(fā)生增生性病變患者的一般情況和血清雌二醇(Estradiol，E2)水平資料，包括對照組39例，增生紊亂69例，單純性增生過長168例，復雜性增生過長67例，不典型增生33例，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌25例，共收集病例401例。所有血液學檢測均在本院檢驗

6、科執(zhí)行。統(tǒng)計分析血清雌激素水平，采用Graph pad prism5.0軟件進行one-way ANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計學差異標準。
　　2.收集2011年9月至2013年12月，子宮內(nèi)膜正常及內(nèi)膜癌患者血清，包括對照組34例，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌34例，共收集病例68例。相同年齡正常及內(nèi)膜癌患者配對比較。ELISA檢測血清雌激素水平。采用Graph pad prism5.0進行paired t test分析，以P=0

7、.05為顯著性統(tǒng)計學差異標準。
　　結果:1.臨床資料顯示，雌二醇水平在各組分布分別為:95.00±68.81ng/L、151.8±163.2 ng/L、156.4±178.8 ng/L、138.4±330.0 ng/L、125.5±156.7 ng/L、36.52±45.35 ng/L，結果不具有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。以40歲為界，將患者分為25～40歲和40～55歲兩個年齡段，25～40歲年齡段中，雌二醇水平在各組分布分

8、別為:107.1±70.73 ng/L、140.3±165.2 ng/L、122.1±129.6 ng/L、76.59±59.86 ng/L和120.1±179.2 ng/L;40～55歲年齡段中，雌二醇水平在各組分布分別為:102.2±63.36 ng/L、161.1±154.5 ng/L、164.0±20.6 ng/L、148.1±152.6 ng/L、148.3±122.5 ng/L和76.86±68.13 ng/L，同一年齡段的

9、各組間雌二醇水平分布不具有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　2.Elisa結果顯示，雌二醇水平在對照組與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組按同一年齡配對比較:P=0.8338，無統(tǒng)計學意義。
　　結論:Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及癌前病變患者血清雌激素水平并不高于內(nèi)膜正常婦女。提示可能存在其他機制參與內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分:巨噬細胞浸潤與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及內(nèi)膜增生性病變的相關性分析
　　目的:檢測巨噬細胞在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌及癌前病變中的

10、浸潤情況，分析二者間的相關性。
　　方法:收集正常及增生性病變子宮內(nèi)膜組織共140例:包括增殖期、分泌期、單純型增生、復雜型增生子宮內(nèi)膜各20例，不典型增生子宮內(nèi)膜、Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌各30例，CD68免疫組化染色，計數(shù)各期別CD68(+)細胞數(shù)，評價CD68(+)巨噬細胞在子宮內(nèi)膜中的浸潤情況。采用Graph pad prism5.0進行one-way ANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計學差異標準。
　　結果:1.CD

11、68表達于巨噬細胞的胞質(zhì)和胞膜。2.各組中CD68+細胞數(shù)目分別是（每400倍視野）:增殖期:6.641±5.463個;分泌期:13.82±10.36個;單純型增生:20.45±10.17個;復雜型增生:35.70±14.73個;不典型增生期:41.98±15.74個;Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌:57.80±25.72個，與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌相比均有P＜0.001，CD68(+)細胞數(shù)與子宮內(nèi)膜增生性病變進展呈正相關。3.隨子宮內(nèi)膜增生性病變進展，巨噬

12、細胞浸潤部位由血管周圍、間質(zhì)向腺上皮轉(zhuǎn)變。4.隨病變進展，巨噬細胞形態(tài)逐漸成熟。
　　結論:CD68(+)巨噬細胞在子宮內(nèi)膜浸潤數(shù)目、部位及形態(tài)可能與Ⅰ子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展有關。
　　第三部分:TAMs通過ERα調(diào)控Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細胞雌激素敏感性
　　目的:研究TAMs在促進Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及內(nèi)膜癌細胞對雌二醇敏感性中的作用，并進一步分析可能的機制。
　　方法:采用兩種雌激素受體陽性的子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishi

13、kawa和HEC-1-A作為研究對象;培養(yǎng)單核細胞系THP-1，并誘導為M2型巨噬細胞，即TAMs;子宮內(nèi)膜癌細胞與M2型THP-1共培養(yǎng)，或經(jīng)M2型THP-1的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，CCK-8檢測共培養(yǎng)前后內(nèi)膜癌細胞增殖情況，以及對生理劑量(10-9M) E2的敏感性改變，并將此變化與過表達ERα或應用ERα抑制劑ICI后的趨勢相比較，采用Graph pad prism5.0進行one-wayANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計學差

14、異標準;Real-time PCR和Western Blot檢測內(nèi)膜癌細胞與M2型THP-1共培養(yǎng)后雌激素受體α(ERα)的表達變化，并采用細胞增殖相關蛋白CyclinD1驗證細胞增殖情況。
　　結果:1.人M2型THP-1巨噬細胞誘導活化成功，形態(tài)改變明顯，表型鑒定CD68、CD163、CD204和CD206顯著升高。2.M2型THP-1與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa或HEC-1-A共培養(yǎng)后，內(nèi)膜癌細胞增殖均被促進;生理劑

15、量的E2對兩株細胞的促增殖作用亦被上調(diào);該現(xiàn)象可被雌激素受體抑制劑ICI抑制。3.M2型THP-1的條件培養(yǎng)基(CM)可時間依賴性促進Ishikawa和HEC-1-A細胞增殖，上調(diào)生理劑量雌激素對內(nèi)膜癌細胞的促增殖作用，其促增殖作用同樣可被ICI抑制。4.M2型THP-1的條件培養(yǎng)基(CM)可時間依賴性上調(diào)雌激素受體α表達，而對雌激素受體β無明顯作用;CM可時間依賴性上調(diào)cyclinD1表達;5.M2型THP-1對雌激素促增殖作用的上調(diào)

16、作用與內(nèi)膜癌細胞過表達ERα后細胞增殖增強情況類似。
　　結論:TAMs可促進子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa和HEC-1-A增殖及對雌激素的敏感性，這種作用可能是通過上調(diào)內(nèi)膜癌細胞雌激素受體α實現(xiàn)的。
　　第四部分:TAMs通過IL-17調(diào)控Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細胞ERα表達
　　目的:篩選TAMs中可能在促進內(nèi)膜癌細胞增殖中起關鍵作用的炎癥因子，研究其在促Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及雌激素敏感性方面的作用，并探索可能的機制。<

17、br>　　方法:M2型THP-1與子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1-A經(jīng)Transwell共培養(yǎng)后，提取M2型THP-1細胞的RNA行Real-time PCR篩選穩(wěn)定作用的炎癥因子;采用CCK-8驗證篩選的炎癥因子對HEC-1-A的促增殖及促雌激素敏感性作用，采用Graph pad prism5.0進行one-wayANOVA分析，以P=0.05為顯著性統(tǒng)計學差異標準;Real-time PCR和Western blot驗證該炎癥因子對HEC

18、-1-A的ERα表達調(diào)控;Western blot驗證該炎癥因子和E2共同作用于HEC-1-A細胞后，對調(diào)控細胞增殖的p-AKT信號通路的活化作用。
　　結果:1.經(jīng)篩選，與HEC-1-A共培養(yǎng)后M2型THP-1細胞炎癥因子IL-10和IL-17表達明顯增加;2.IL-10和IL-17均可上調(diào)E2對HEC-1-A細胞的促增殖作用，且IL-17作用更強;3.IL-10、IL-17或E2處理后，均可上調(diào)HEC-1-A的ERα表達，且I

19、L-17作用更強，進一步篩選出IL-17作為研究對象;4.IL-17與E2共同處理HEC-1-A細胞后，其p-AKT信號通路活化顯著增強，此作用與HEC-1-A細胞轉(zhuǎn)染過表達ERα后加用E2相似。
　　結論:TAMs通過IL-17上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細胞ERα的表達，從而促進內(nèi)膜癌細胞對雌激素敏感性增加，增強雌激素對內(nèi)膜癌細胞的促增殖作用。
　　上述結果提示:1.血清雌激素水平與Ⅰ型子宮內(nèi)膜增生性病變的進展無顯著相關性，雌激素對內(nèi)

20、膜的促癌作用可能存在其他機制;2.巨噬細胞浸潤與Ⅰ型子宮內(nèi)膜增生性病變進展呈正相關，慢性炎癥可能在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用;3.腫瘤相關巨噬細胞通過上調(diào)內(nèi)膜癌細胞雌激素受體α表達增強雌激素對Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細胞的促增殖作用，慢性炎癥對雌激素敏感性的調(diào)控可能是Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的重要原因;4.腫瘤相關巨噬細胞通過分泌炎癥因子，如白介素-17，上調(diào)內(nèi)膜癌細胞雌激素受體α表達，從而提高內(nèi)膜細胞對雌激素敏感性。可能是內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展