雌激素調(diào)節(jié)豬炎性子宮內(nèi)膜細胞的分子機制.pdf

1、母豬子宮內(nèi)膜炎是指母豬子宮黏膜的粘液性或化膿性炎癥，可造成母豬發(fā)情異常，是造成規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)中母豬高淘汰率的最重要疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。有調(diào)查顯示，在養(yǎng)豬業(yè)中，患有子宮內(nèi)膜炎的分娩母豬高達20%。子宮內(nèi)膜炎主要由病毒、細菌及寄生蟲等引起。目前，對子宮內(nèi)膜炎的治療主要采用抗生素、中藥、生物制劑等進行治療，雖然具有較好的效果，但是，以上治療方法并不能徹底治療該病，且存在一定的副作用，嚴重影響患畜病后的繁殖能力。因此，對于家畜子宮內(nèi)

2、膜炎，應該防重于治，在弄清其發(fā)病機制的基礎上，采取更加有效的防治手段，最終使該病得到有效控制。
　　雌激素主要成分是17β-雌二醇（17β-E2），子宮是雌激素作用的重要靶器官。研究表明，多種子宮疾病均與雌激素有密切聯(lián)系，雌激素分泌情況的異常通常會導致某些子宮疾病。國內(nèi)外研究證明，雌激素可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜炎。本實驗利用體外培養(yǎng)的豬子宮內(nèi)膜上皮細胞，探究17β-E2對母豬子宮內(nèi)膜上皮細胞炎性因子的調(diào)控機制。其主要目標為：
　　（

3、1）體外培養(yǎng)并純化豬子宮內(nèi)膜上皮細胞；
　?。?）建立在體外條件下豬子宮內(nèi)膜上皮細胞的炎癥模型；
　　（3）探究17β-E2對子宮內(nèi)膜上皮細胞NO、TNF-α、IL-1表達的調(diào)控作用；
　　（4）探究雌激素α受體拮抗劑在17β-E2調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細胞炎性因子表達過程中的作用；
　?。?）探究JNK信號通路在17β-E2調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細胞炎性因子表達過程中的作用。
　　研究如下：
　　（1）實驗選取

4、健康母豬正常子宮，將其子宮內(nèi)膜剝離，進行原代培養(yǎng)、純化和傳代培養(yǎng)，最終獲得體外子宮內(nèi)膜上皮細胞，經(jīng)過角蛋白免疫熒光染色鑒定，子宮內(nèi)膜上皮細胞的純化率達95%以上，為后續(xù)研究提供了高純度、符合要求的細胞；
　?。?）為了探究制備豬子宮內(nèi)膜上皮細胞炎癥模型需要的LPS劑量，實驗選取1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL的脂多糖刺激體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細胞12h。通過MTT試驗測定細胞的活性，并通過NO試劑盒、ELISA、RT

5、-PCR方法檢測細胞培養(yǎng)液中NO、TNF-α、IL-1和NOS、TNF-α、IL-1的mRNA的表達量。結果顯示，10μg/mL的LPS能顯著提高子宮內(nèi)膜上皮細胞的活性且能增加NO、TNF-α、IL-1和NOS、TNF-α、IL-1的mRNA的表達量，與對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；LPS的濃度和炎性因子的分泌量呈劑量相關性，但由于100μg/mL的LPS顯著降低了細胞活性，因此后期實驗選取10μg/mL的LPS對子宮內(nèi)膜上皮細

6、胞進行刺激，制作炎癥模型；
　?。?）為了探究17β-E2對子宮內(nèi)膜上皮細胞炎性因子的影響，采用10μg/mL的LPS刺激子宮內(nèi)膜上皮細胞12h后，分別選取10-6M，10-7M，10-8M的17β-E2處理激發(fā)培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細胞，通過NO試劑盒、熒光定量PCR和ELISA分別檢測在2h、6?h、12?h、24?h的NO、TNF-α、IL-1和NOS、TNF-α、IL-1的 mRNA表達水平。結果顯示，三種濃度的17β-E2均

7、不同程度的降低了炎性因子的表達量，且這種降低程度與17β-E2的濃度呈正比。
　?。?）為了探究雌激素受體α在17β-E2調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細胞炎性因子中的作用，實驗用10μg/mL LPS激發(fā)培養(yǎng)12h后，加入含濃度為10-6M17β-E2、10-6M17β-E2+三氧苯胺（TAM）的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，通過NO試劑盒、ELISA、熒光定量PCR檢測NO、NOS、TNF-α、IL-1的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，LPS+17β-E2組

8、炎性因子的分泌顯著降低，而LPS+17β-E2+TAM組炎性因子的分泌與LPS+17β-E2組差異顯著，與LPS組差異不顯著，表明雌激素受體α在17β-E2調(diào)節(jié)炎性因子表達過程中發(fā)揮了重要作用。
　?。?）為了了解JNK信號轉(zhuǎn)導通路在17β-E2對子宮內(nèi)膜細胞炎性因子調(diào)節(jié)過程中的作用，實驗測定了LPS組、LPS+17β-E2組以及LPS+TAM+17β-E2的P-JNK和JNK蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)LPS組的P-JNK水平顯著提高，而

9、加入17β-E2后則顯著降低了P-JNK的表達水平，加入TAM后P-JNK的蛋白表達量比LPS+17β-E2組顯著提高，與LPS組無顯著差異。表明雌激素可能通過與雌激素受體α作用，抑制JNK路徑，從而抑制LPS刺激下的細胞因子的表達。
　　綜上所述，該實驗可以得到以下結論：
　　1.本實驗成功培養(yǎng)了豬子宮內(nèi)膜上皮細胞并建立了該細胞炎癥模型。
　　2.雌激素可抑制LPS引起的子宮內(nèi)膜上皮細胞的炎性因子的NO、TNF-α、