產(chǎn)γ-谷氨基甲酰胺合成酶的菌株的選育.pdf

1、γ-谷氨基甲酰胺合成酶(γ-glutamylmethylamide synthetase，γ-GMAS)(EC6.3.4.12)是一種連接酶，可在ATP和Mn2+存在的條件下催化谷氨酸和甲胺合成γ-谷氨基甲酰胺。γ-谷氨基甲酰胺與茶氨酸（γ-谷?；阴０罚┑慕Y(jié)構(gòu)很相似，因此在一定條件下γ-谷氨基甲酰胺合成酶可同樣催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸，這為茶氨酸的合成提供了又一思路。
　　 目前國(guó)外報(bào)道該酶主要存在于細(xì)菌體內(nèi)，包括普通生絲微

2、菌，假單胞菌以及一些以甲胺為唯一碳氮源的海生甲基營(yíng)養(yǎng)生物。近年來(lái)國(guó)外關(guān)于γ-谷氨基甲酰胺合成酶合成茶氨酸的研究報(bào)道較多，但是尚未見(jiàn)到關(guān)于假單胞菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)γ-谷氨基甲酰胺合成酶的相關(guān)報(bào)道，鑒于此，本論文對(duì)假單胞菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)γ-谷氨基甲酰胺合成酶進(jìn)行了研究。首先利用紫外線(xiàn)誘變假單胞菌，從中篩選出產(chǎn)γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活較高的優(yōu)勢(shì)突變菌株；然后通過(guò)PlackettBurman和RSM響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件，提高酶產(chǎn)量；最后對(duì)γ-谷氨

3、基甲酰胺合成酶進(jìn)行粗提并研究了其部分酶學(xué)性質(zhì)，以期為γ-谷氨基甲酰胺合成酶的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果有：
　　 首先，以假單胞菌為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外誘變處理，經(jīng)過(guò)初篩復(fù)篩獲得了一株產(chǎn)γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活較高并且遺傳穩(wěn)定性較好的優(yōu)勢(shì)突變菌株UV-19。
　　 其次，以紫外誘變獲取的優(yōu)勢(shì)突變菌株為實(shí)驗(yàn)菌株，發(fā)酵所產(chǎn)γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活為指標(biāo)，篩選出了發(fā)酵產(chǎn)酶的最適碳源、氮

4、源、溶氧轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)底物，并通過(guò)Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)篩選發(fā)酵培養(yǎng)的主要影響因素，確定了突變菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基主要影響因素為葡萄糖(p=0.0003)、蛋白胨(p=0.0244)、起始pH值(p=0.0033)和裝液量(p=0.0122)。
　　 再次，在PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活為指標(biāo)，運(yùn)用響應(yīng)面法(Response Surface Methodology,RS

5、M)的旋轉(zhuǎn)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)篩選出的主要影響因素進(jìn)一步優(yōu)化，確定了優(yōu)勢(shì)突變菌株發(fā)酵產(chǎn)γ-谷氨基甲酰胺合成酶最適宜的發(fā)酵產(chǎn)酶條件：葡萄糖15.0g/L、蛋白胨12.0g/L、氯化鈉5.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、甲胺鹽酸鹽1.0g/L、起始pH值6.5、裝液量72mL/250mL、發(fā)酵時(shí)間42h、溫度30℃、轉(zhuǎn)速160r/min。
　　 最后，對(duì)優(yōu)勢(shì)突變菌株所產(chǎn)γ-谷氨基甲酰胺合成酶進(jìn)行粗提，對(duì)粗酶的部分