谷氨酰胺合成酶產(chǎn)酶菌株的篩選.pdf

1、谷氨酰胺合成酶(GS，glutaminesynthetase; EC6.3.1.2)是生物體內(nèi)廣泛存在的酶，它參與許多生物體的氮和碳代謝。而氮代謝是生物體維持生命所必需的，因此，它是生物體內(nèi)最為關(guān)鍵的酶類(lèi)之一。谷氨酰胺合成酶在生物體內(nèi)的分布及生理功能的研究也很透徹。此外，它也是體外微生物酶促轉(zhuǎn)化合成茶氨酸的重要酶類(lèi)之一，更是谷氨酰胺工業(yè)化生產(chǎn)中極其重要的催化劑，是非常有價(jià)值的物質(zhì)，故對(duì)其需求量也日益增多。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺合成酶

2、是條經(jīng)濟(jì)而又高效的途徑。目前谷氨酰胺合成酶的產(chǎn)酶菌株主要是節(jié)桿菌屬的一些細(xì)菌。而利用霉菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺合成酶的研究卻很少，米曲霉更是沒(méi)被研究過(guò)。本實(shí)驗(yàn)首先從實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株中篩選出具有較高產(chǎn)酶能力的米曲霉，并對(duì)其進(jìn)行紫外誘變、優(yōu)化發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)的研究。
　　 實(shí)驗(yàn)中首先從實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株中篩選出具有較高產(chǎn)谷氨酰胺合成酶能力的米曲霉。進(jìn)而對(duì)米曲霉進(jìn)行紫外誘變，誘變條件為：紫外燈15W，照射距離20cm，照射時(shí)間120S。最后

3、，經(jīng)過(guò)、復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，選育出的誘變菌株產(chǎn)谷氨酰胺合成酶的能力比出發(fā)菌株提高了15.6％。
　　 其次，對(duì)選育出的米曲霉進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，先進(jìn)行單因子實(shí)驗(yàn)，篩選出米曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)谷氨酰胺合成酶的最適碳源、氮源、起始pH、裝液量、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速和誘導(dǎo)因子。結(jié)果表明最適碳源為蔗糖，最適氮源為蛋白胨，最適起始pH為6，最適裝液量為60ml，最適發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28℃，最適搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，最適誘導(dǎo)因子為谷氨酸鈉。再

4、通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定四種顯著影響因子的添加量，優(yōu)化培養(yǎng)基的成分和液體發(fā)酵條件，使選育出的米曲霉產(chǎn)谷氨酰胺合成酶的能力進(jìn)一步提高。
　　 再次，對(duì)超聲波破碎器破碎米曲霉細(xì)胞壁的條件進(jìn)行研究，分別設(shè)定不同的工作時(shí)間和間隔時(shí)間，再對(duì)總時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明在超聲波破碎器功率為400W的條件下，工作1S，間隔3S，20min，是破碎米曲霉細(xì)胞壁的最適破碎條件。
　　 最后，對(duì)提取的谷氨酰胺合成酶的粗酶液進(jìn)一步的純化，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)米曲霉