淀粉液化芽孢桿菌β-葡聚糖酶基因的克隆與表達.pdf

1、β-1，3-1，4-葡聚糖酶能夠有效地降解植物和微生物細胞壁來源的β-葡聚糖，通過添加外源β-葡聚糖酶可有效解決啤酒釀造中麥汁過濾困難，啤酒的非生物穩(wěn)定性降低等問題，在飼料工業(yè)中也可提高禽畜對麥類飼料養(yǎng)分的吸收效率。如何獲得高產β-葡聚糖酶的菌株已經成為目前研究的熱點之一。本文主要以一株高產β-1，3-1，4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)為出發(fā)菌，構建了一株高效表達β-1，3-1，4-

2、葡聚糖酶的大腸桿菌(Escherichiacoli)重組菌，并對重組酶的分離純化和酶學性質進行了研究。 通過PCR手段將本研究室保藏的一株高產β-1，3-1，4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢桿菌的bgl基因(GenBank數據庫編號EU623974)擴增，克隆至三種不同性質的表達質粒載體oEGX-4T-1、pET20b(+)和pET28a(+)中，構建了重組質粒pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)

3、-bgl。將pEGX-4T-1-bgl轉化三種不同的大腸桿菌宿主；pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl分別轉化E.coliBL21(DE3)，采用IPTG在30℃下誘導表達重組蛋白，比較pEGX-4T-1的GST融合表達、pET20b(+)的PelB信號肽指導的分泌型表達和常用的帶有強啟動子和lac操作子的pET28aa[+)的組氨酸標簽和T7標簽的融合表達的效果。經SDS-PAGE分析和酶活測定表明，五種重組菌均表達

4、出了重組蛋白，其中重組菌E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl具有最高的表達酶活，總酶活可達322.0±8.8U/mL，明顯高于其他四種重組菌，為出發(fā)菌在最適搖瓶條件下所產酶活的40.1％，可以作為今后定向改造的適宜菌株。 為了考察E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl所產重組酶的實用價值，本文比較了制備粗酶液時各種破壁方法對重組酶活力的影響，結果表明凍融法效果較好。粗酶液經乙醇分級沉淀和

5、DEAE-650M離子交換層析分離純化，經SDS-PAGE驗證，得到了較純的重組酶，純化倍數為19.85倍，回收率為20.60％，比活力為13,437U/mg，分子量為30kDa左右。 對純化后的重組酶的酶學性質研究表明，重組酶最適pH值為6.0，在pH4.5-6.0范圍內較為穩(wěn)定；最適溫度為50℃，40-50℃范圍內較穩(wěn)定，10mmol/L的Cu2+和Fe2+對酶活有顯著的抑制作用，與野生酶性質大致相同，表明該酶在啤酒釀造工業(yè)