枯草芽孢桿菌J18β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、表達(dá)與應(yīng)用研究.pdf

1、由鏈格孢霉[Alternaria alternate(Fr.) Keissler]引起的黑斑病是梨采后儲(chǔ)藏期的主要病害之一，影響梨果的儲(chǔ)藏時(shí)間及品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)室從梨果園土樣中篩選到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus substilis）J18，研究發(fā)現(xiàn)該菌分泌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有抑制黑斑病菌的活性。本研究主要對(duì)J18的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因進(jìn)行了克隆，并在大腸桿菌中表達(dá)，分析了重組酶的抗真菌活性

2、及酶學(xué)特性，為該酶在生物防治方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　根據(jù)已報(bào)道β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列信息設(shè)計(jì)引物，以J18基因組DNA為模板，經(jīng)PCR高保真擴(kuò)增獲得了該酶編碼基因的全序列，并克隆到pMD-18T載體上。該基因序列全長(zhǎng)為648bp，共編碼215個(gè)氨基酸，含有糖基水解酶F16家族的保守序列EIDIEF，分子量為24.3kDa，等電點(diǎn)為5.77。核苷酸序列分析表明，該酶與已報(bào)道芽孢桿菌屬的β-1,3-1,4-葡聚糖酶

3、的相似性最高達(dá)99％。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，J18菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因與其同屬枯草芽孢桿菌來(lái)源的親緣關(guān)系最近。將該基因插入到表達(dá)載體pET28a(+)上，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，通過(guò)IPTG成功誘導(dǎo)表達(dá)。
　　重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶抗真菌實(shí)驗(yàn)表明：該酶可以顯著地控制梨鏈格孢霉孢子的萌發(fā)和芽管的伸長(zhǎng)，并對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有破壞作用。通過(guò)在梨果上損傷接種和直接噴施重組酶及病原菌的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：接種重組酶后梨果的病

4、斑直徑小于只接種病原菌的病斑直徑，且腐爛程度也明顯低于對(duì)照；梨果經(jīng)酶液處理后，發(fā)病率為37.61%，防病效果為66.25%。β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有抗梨黑斑病菌活性尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶的特性研究表明：重組酶在溫度低于55℃條件下處理30min后抑菌活性與對(duì)照相比差異不顯著，超過(guò)55℃抑菌活性開始緩慢下降。pH為6.0時(shí)，抑菌活性最高，在5.0-8.0之間仍然處于較高的抑菌活性狀態(tài)。光照對(duì)重組酶