宏基因組測(cè)序技術(shù)在腸道菌群研究和臨床樣本檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、人體的各個(gè)部位定居這大量的微生物，其數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)人體自身的細(xì)胞數(shù)，約有1x1014之多。這些微生物與人體有著密切的關(guān)系，在代謝活動(dòng)中發(fā)揮這不可或缺的作用，同時(shí)當(dāng)某一些微生物出現(xiàn)在相關(guān)部位或者其數(shù)量，特征發(fā)生改變時(shí)會(huì)影響機(jī)體的健康，誘發(fā)疾病。
　　其中腸道是微生物定植最多的場(chǎng)所。腸道菌群與人類(lèi)維持著共生關(guān)系，腸道的厭氧環(huán)境為菌群提供了生存條件，同時(shí)腸道菌群參與了人體的代謝活動(dòng)，分解食物中的復(fù)雜大分子，維生素的合成，結(jié)合膽汁酸的生物轉(zhuǎn)

2、化等，完成了許多人體細(xì)胞自身不具備的代謝功能。
　　因此，研究人體中的微生物，探究其與人體的相互作用以及微生物與疾病的關(guān)系，將微生物學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)相結(jié)合，探索出新型的疾病預(yù)防控制途徑，促進(jìn)人類(lèi)健康,具有重大意義。
　　受限于傳統(tǒng)的微生物學(xué)研究方法主要依賴(lài)于微生物的培養(yǎng)和分離鑒定，然而在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件下，絕大多數(shù)微生物無(wú)法通過(guò)上述手段獲得，因此需要發(fā)展出一條不同于傳統(tǒng)方法的研究途徑。近年來(lái)，隨著宏基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，一些非培養(yǎng)

3、的技術(shù)手段在微生物研究中發(fā)揮著日益重要的作用。
　　宏基因組測(cè)序技術(shù)不依賴(lài)對(duì)樣本中微生物群落的培養(yǎng)，直接對(duì)樣本進(jìn)行核酸提取，測(cè)定樣本中所有微生物的核酸序列，這樣可避免培養(yǎng)過(guò)程中帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)污染。宏基因組測(cè)序包括16S rDNA和全基因組測(cè)序兩種手段。16S rDNA測(cè)序?qū)?xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序；全基因組測(cè)序不依賴(lài)擴(kuò)增，直接將微生物基因組提取后進(jìn)行測(cè)序。
　　病毒宏基因組學(xué)（viral mretagenomic

4、s）是在宏基因組學(xué)（metagenomics）理論的基礎(chǔ)上興起的一個(gè)新的學(xué)科的分支，近年來(lái)，在病毒病原體（已知或未知）發(fā)現(xiàn)與動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。病毒宏基因組學(xué)不依賴(lài)傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，直接以樣本中所有病毒的遺傳物質(zhì)為研究對(duì)象，快速鑒定出樣品中所有病毒組成狀況。近年來(lái)，許多人、動(dòng)物和植物病毒的發(fā)現(xiàn)很大程度上受益于病毒宏基因組學(xué)的發(fā)展。
　　本文借助宏基因組測(cè)序技術(shù)，探索了樣本中的菌群構(gòu)成和差異，篩查出臨床樣本中的病原體。

5、　　為探索不同環(huán)境下腸道菌群構(gòu)成的變化，我們借助動(dòng)物模型，提取了不同周齡和飲食狀態(tài)下小鼠糞便中的細(xì)菌核酸，共16組，128份，擴(kuò)增了16S rDNA的V3V4高變區(qū)，之后進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序，分析其中的菌群豐度和構(gòu)成差異。
　　我們對(duì)在一批急性呼吸道疾病病人的咽拭子進(jìn)行病毒宏基因組測(cè)序時(shí)，優(yōu)化了生物信息分析方法，加快了數(shù)據(jù)分析的速度，發(fā)現(xiàn)了Torque teno virus含量的上升，表明急性上呼吸道感染的一些病毒感染含量的變動(dòng)可作為一些

6、未知的原因的疾病的生物標(biāo)志物的可能性。
　　核酸提取是宏基因組測(cè)序的基礎(chǔ)，直接影響到后期建庫(kù)測(cè)序和數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量。我們利用一株細(xì)菌作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，從基因組DNA的純度、濃度、完整性、一致性和宏基因組測(cè)序結(jié)果五個(gè)方面評(píng)估兩種DNA分離試劑盒優(yōu)化前后四種方法提取巨型球菌基因組DNA的效率，為提取制備困難的巨型球菌基因組DNA的方法選擇提供參考，探索宏基因組測(cè)序前樣本處理的方法。
　　綜合以上內(nèi)容，我們利用宏基因組學(xué)技術(shù)，對(duì)一批小鼠