全基因組拷貝數變異檢測在產前高通量測序異常信號分析中的應用研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著細胞遺傳學及分子遺傳學的發(fā)展，產前篩查和產前診斷的技術及方法也呈多元化發(fā)展，目前國內常用的中孕期母血清學產前篩查，可以對發(fā)病率較高的13、18、21-三體及神經管畸形的胎兒進行篩查。此外，早孕期母血清學篩查、早孕期胎兒NT值等超聲指標篩查、早中孕期母血清學聯合篩查等方案，有的地區(qū)也有開展。但無論以上哪種篩查方式，對胎兒非整倍體的篩查效率都偏低，假陽性率較高。上述篩查高風險的孕婦，可于早、中或晚孕期通過采集胎兒細

2、胞、組織等樣本來進行胎兒遺傳物質的檢測，經早孕期絨毛穿刺活檢、中孕期羊膜腔穿刺、中晚孕期胎兒臍帶穿刺或個別嚴重畸形兒的心臟穿刺等有創(chuàng)手術操作來獲取胎兒細胞進行檢測，其準確性較高，但從安全性上來講，有創(chuàng)的產前診斷方式不適合作為一種大范圍的篩查手段，臨床上迫切需要篩查效率更高的篩查技術方法。
　　有研究表明基因組拷貝數變異(Copy Number Variations，CNVs)在某些人類疾病中扮演著重要角色。一些染色體微重復微缺失綜

3、合征，如:Williams-Beuren綜合征、Angelman/Prader-Willi綜合征、Charcot-Marie-Tooth綜合征等，均是由CNVs或染色體片段的缺失或重復導致[1-3]。如單核苷酸多態(tài)性一樣，多數CNVs以正常多態(tài)形式存在，只有少數的CNVs與疾病相關。染色體微陣列分析(Chromosomal Microarray AnalysisCMA)即:比較基因組雜交微陣列和單核苷酸多態(tài)微陣列的出現，大大的提高了人類

4、基因組CNVs的發(fā)現。因其高通量、高分辨率、無需培養(yǎng)等優(yōu)點，染色體微陣列技術在產前診斷領域中的應用價值逐漸得到認可。
　　近年來，研究發(fā)現孕婦外周血血漿游離DNA中含有一定比例的胎兒游離DNA，其DNA片段長度較小，絕對含量隨著孕周的增長而增加，且可在分娩后快速降解消失，為提取和檢測孕婦血漿游離DNA作為獲取胎兒遺傳信息的無創(chuàng)檢測技術提供了可能[1-4]。
　　新一代高通量測序技術是可以同時進行數百萬個核苷酸單分子序列測序分

5、析的技術，其基本原理是:首先將基因組DNA片段化，隨后加入測序的接頭和引物，簇生成后進行橋式擴增，將片段連接到flowcell上，每個反應進行時均加入一個可逆終止的脫氧核苷酸，進行熒光掃描。這種高通量，高精確度的測序技術的出現，在孕婦血漿中具有相對穩(wěn)定比例的游離胎兒DNA的基礎上，大大推動了無創(chuàng)產前檢測(Noninvasive Prenatal Testing，NIPT)技術的應用。
　　染色體的非整倍體是臨床上最常見的染色體異常

6、，且多數是重大致殘致愚性遺傳病。母血漿中游離胎兒DNA的發(fā)現及在此基礎上高通量測序技術的應用，開創(chuàng)了胎兒染色體非整倍體等遺傳病的無創(chuàng)產前檢測的新紀元。世界各地多個研究小組對該方法進行的大量臨床研究表明，目前該技術針對最常見的21-三體的無創(chuàng)產前檢測的靈敏度和特異性均已達到99％以上。最新研究已證實可以從孕婦血漿游離DNA中拼接出胎兒和孕婦的全基因組信息，為以孕婦血漿游離DNA為研究材料進行胎兒CNVs甚至單基因病的檢測提供了研究基礎[5

7、-8]。
　　目的：
　　針對臨床上具有NIPT指征的高危孕婦，應用新一代高通量測序技術進行產前檢測，搜集、整理NIPT檢測過程中出現的各種染色體非整倍體異常信號以及CNVs相關異常信號病例，利用有創(chuàng)產前診斷技術獲取胎兒細胞后，采用染色體微陣列分析技術進行檢驗、驗證，分析NIPT在染色體數目異常和致病性CNVs檢測中的準確性，以判斷NIPT的臨床應用價值、明確致病性CNVs的診斷并提供臨床咨詢，同時也可為CNVs數據庫提供新

8、的科研數據。
　　方法：
　　門診具有NIPT指征的孕婦常規(guī)進行知情告知，經高通量測序和數據分析后，以NIPT篩查結果提示胎兒13、18、21、性染色體非整倍體高風險以及提示胎兒CNVs異常信號的孕婦為研究對象。知情同意后行有創(chuàng)產前診斷，根據孕周需要獲取胎兒羊水或臍血等標本分別進行胎兒染色體微陣列芯片分析。若經有創(chuàng)產前診斷驗證胎兒為13、18、21或性染色體非整倍體，對孕婦夫婦進行遺傳咨詢;若經有創(chuàng)產前診斷驗證胎兒確實存在異

9、常CNVs，進一步復查胎兒父母的外周血染色體微陣列芯片，以明確此CNVs的遺傳來源，并根據最終的染色體微陣列芯片結果進行遺傳咨詢。
　　結果：
　　對臨床上有適應癥的孕婦外周血樣本進行胎兒染色體非整倍體NIPT篩查，共篩出21-三體高風險16例、18-三體高風險3例，經有創(chuàng)產前診斷進行胎兒染色體核型和染色體微陣列檢驗、驗證后，確認其中21三體兒15例、18三體兒3例;其中1例NIPT篩查為21-三體高風險的胎兒，臍血染色體核

10、型和臍血CMA檢測結果均為46，XX，產前診斷證實該例為21三體假陽性，出生后隨訪正常。
　　共篩查提示性染色體非整倍體病例9例，經有創(chuàng)產前診斷確認了其中5例存在性染色體非整倍體，分別為47，XXX2例，47，XXY1例，47，XYY1例，47，XYY/46，XY嵌合體1例，其余4例未檢出性染色體異常，為假陽性。
　　此外，NIPT提示13號染色體微缺失病例1例，18號染色體微重復病例1例，18號染色體部分缺失病例1例，染色