宏基因組研究高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的肥胖易感性與腸道菌群的關(guān)系.pdf

1、肥胖癥是一種營(yíng)養(yǎng)障礙性疾病，典型特征為超重，脂肪過(guò)多，原因主要是能量代謝失調(diào)，出不敷入。與單純性肥胖不同，過(guò)度肥胖會(huì)成為多種代謝疾病的誘因，比如糖尿病、心血管疾病、慢性腎病等。其在2003年被世界衛(wèi)生組織定義為全球性流行病，患病率在未來(lái)十年估計(jì)會(huì)增長(zhǎng)40％，已成為危害人類健康的主要疾病之一。而現(xiàn)代肥胖發(fā)生的諸多誘因中不規(guī)律飲食及飲食結(jié)構(gòu)不合理，機(jī)體攝入過(guò)多熱量成為主要因素。長(zhǎng)期的高熱量飲食（高脂肪、高蛋白、高糖）會(huì)誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生，引起人

2、體代謝紊亂，促進(jìn)各種并發(fā)癥，危害極大。在現(xiàn)實(shí)生活中，人們發(fā)現(xiàn):同樣攝入高脂飲食的人，有的人就是“吃不胖”，有的人攝入量很有限，但仍然容易長(zhǎng)胖，自稱“喝水也胖”?？梢?jiàn)，肥胖有個(gè)體代謝與遺傳學(xué)差異。對(duì)于高脂飲食誘導(dǎo)的群體除了人類以外，小鼠作為科學(xué)研究中普遍運(yùn)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屢屢被用到。早在20世紀(jì)80年代初期，Levin等用高脂飲食飼喂同一批次Sprague-Dawley大鼠后發(fā)現(xiàn)，一部分大鼠會(huì)發(fā)生肥胖，稱為飲食誘導(dǎo)的肥胖(diet-induc

3、ed obesity,DIO)，而另一部分大鼠并未發(fā)生肥胖，稱為飲食誘導(dǎo)的肥胖抵抗(diet-induced obesity resistance，DIOR)。由此可見(jiàn)，同種動(dòng)物不同個(gè)體對(duì)于高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖易感性存在差異。近年的研究表明，高脂飲食會(huì)影響人體腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)和功能，而腸道菌群被稱為人體的“第二基因組”，能參與調(diào)節(jié)多種代謝途徑，維持腸道微生態(tài)平衡，其中脂代謝、碳水化合物代謝等與肥胖的發(fā)生有著密切的關(guān)系，而人們對(duì)腸道菌群與

4、個(gè)體肥胖易感性的關(guān)系遠(yuǎn)沒(méi)有那么清晰的認(rèn)識(shí)。得益于宏基因組學(xué)的發(fā)展，對(duì)于腸道菌群的結(jié)構(gòu)功能有了進(jìn)一步了解，借助于生物信息學(xué)分析工具，能讓深入了解腸道菌群與高脂飲食誘導(dǎo)的不同個(gè)體肥胖易感性的關(guān)系，有助于深入探索腸道菌群在肥胖發(fā)生中扮演的角色。本研究利用高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠用以建立肥胖和肥胖抵抗模型，通過(guò)宏基因組學(xué)分析比較不同模型小鼠腸道菌群在結(jié)構(gòu)組成與功能上的差異，探討腸道菌群與肥胖及肥胖抵抗之間的聯(lián)系。以下為主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果

5、:
　　1.高脂飲食小鼠模型的構(gòu)建及判定:取30只C57BL/6J小鼠，10只作為對(duì)照，飼喂普通飼料，20只作為模型組，飼喂高脂飼料。造模期結(jié)束后，超過(guò)對(duì)照組小鼠體重平均增長(zhǎng)率的2倍的小鼠劃定為“高脂飲食誘導(dǎo)肥胖組”(HFDIO組)，共8只，其余未達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)的稱為“高脂飲食誘導(dǎo)肥胖抵抗組”(HFDIOR組)，共12只。
　　2.小鼠糞便的收集與基因組DNA提取，宏基因組測(cè)序:采用腹部按摩法在造模期結(jié)束后取小鼠新鮮糞便，按照

6、QIAamp(@)Fast DNA Stool Mini kit說(shuō)明書(shū)（購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司）提取糞便中的DNA，檢測(cè)濃度、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組完整性后，基因組樣品置于干冰中，委托深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序。質(zhì)檢后選擇未降解的18個(gè)樣品(Control6只，HFDIO7只，HFDIOR5只)進(jìn)行宏基因組文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序，并進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控、過(guò)濾、組裝和基因集構(gòu)建。
　　3.高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群物種注釋與物種豐度

7、分析:所得基因集與NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)nr進(jìn)行比對(duì)。經(jīng)過(guò)物種注釋及豐度分析發(fā)現(xiàn)，相比Control組，HFDIO組和HFDIOR組小鼠腸道擬桿菌門(mén)顯著下降，厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、變形菌門(mén)含量顯著升高。HFDIO組和HFDIOR組小鼠腸道在變形菌門(mén)、螺旋體門(mén)、疣微菌門(mén)有一定差異，而在厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、變形菌門(mén)差異上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　4.宏基因組多樣性分析:多樣性分析分為α多樣性分析和3多樣性分析。通過(guò)α多樣性分

8、析發(fā)現(xiàn)Control組腸道菌群多樣性遠(yuǎn)高于高脂組小鼠，HFDIO組和HFDIOR組差異不明顯。通過(guò)β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，Control組、HFDIO組與HFDIOR組無(wú)論在物種組成，基因功能還是代謝途徑上都存在較大差異。物種組成上，高脂飲食誘導(dǎo)的2組小鼠趨于相似，并有交互，但與對(duì)照組有較大差距，聚類分析提示有性別差異;而在基因功能和代謝途徑上，3組小鼠都有明顯差異，Control組與HFDIOR組距離較近，提示在關(guān)鍵基因功能上HFDIOR組

9、小鼠的腸道菌群未受到較大損傷，HFDIO組小鼠可能已處于代謝紊亂狀態(tài)。
　　5.宏基因組關(guān)鍵生物標(biāo)記物的篩選:通過(guò)線性判別效應(yīng)量(LEfSe)分析，發(fā)現(xiàn)Control組的關(guān)鍵物種是擬桿菌屬和普雷沃氏菌屬，從屬于擬桿菌門(mén);HFDIO組的關(guān)鍵物種只有Lachnospiraceae bacterium28-4，從屬于厚壁菌門(mén);HFDIOR組最關(guān)鍵的物種是Lachnospiraceae bacterium10-1，從屬于厚壁菌門(mén)。

10、　　6.GO功能顯著性差異分析:通過(guò)基因本體(Gene Ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(kù)分析比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)，HFDIO組和HFDIOR組小鼠在細(xì)胞組成、分子功能、生物學(xué)途徑都存在較大差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）的共有23項(xiàng)，重要差異有氧還原酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、核酸結(jié)合活性。
　　7.KEGG Pathway差異分析:通過(guò)將基因與KEGG(京都基因與基因組百科全書(shū))數(shù)據(jù)庫(kù)中的代謝通路分析數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)，HFDIO組和H

11、FDIOR組小鼠存在較大差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)的共有17項(xiàng)，關(guān)鍵差異集中在碳水化合物代謝。
　　8.高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腸道病毒物種注釋與物種豐度分析:通過(guò)比對(duì)NCBI的nr、virus數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，相比Control組，HFDIO組和HFDIOR組小鼠腸道肌尾噬菌體科、微小噬菌體科有所下降，HFDIOR組短尾噬菌體科下降明顯。HFDIO組和HFDIOR組小鼠腸道病毒未發(fā)現(xiàn)顯著差異(P＞0.05）。
　　9.病毒

12、組與腸道細(xì)菌關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析:18類病毒與46種細(xì)菌產(chǎn)生183條關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)線條，其中82條為負(fù)相關(guān)，其余101條為正相關(guān)。首次在小鼠腸道中發(fā)現(xiàn)大量主要宿主為擬桿菌屬的crAssphage。
　　綜上所述，通過(guò)宏基因組對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠和肥胖抵抗小鼠在腸道菌群群落結(jié)構(gòu)組成，關(guān)鍵物種，基因功能和代謝途徑的比較得出，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖組和肥胖抵抗組小鼠在個(gè)體肥胖易感性上確實(shí)有很大不同，推測(cè)關(guān)鍵菌群的基因功能對(duì)肥胖的發(fā)生或抵抗有著重要的作