MTDH基因轉染對乳腺癌細胞株MCF-7增殖和紫杉醇敏感性影響的研究.pdf

1、目的：乳腺癌是世界上女性最常見的惡性腫瘤之一，且乳腺癌發(fā)病呈持續(xù)上升趨勢。乳腺癌的復發(fā)、轉移和多藥耐藥仍是臨床亟待改善和解決的難題。MTDH原癌基因增強腫瘤細胞的增殖及抗凋亡能力,促進腫瘤新血管生成,并與腫瘤細胞侵襲、擴散、轉移及化療耐藥相關。本實驗研究MTDH高表達對乳腺癌MCF-7細胞增殖及對紫杉醇耐藥性的影響。
　　方法：
　　1.慢病毒介導 MTDH高表達的 MCF-7穩(wěn)轉細胞株的構建和鑒定：MTDH基因表達質粒，經

2、大腸桿菌轉化擴增，提取純化后送測序鑒定。測序成功后使用慢病毒感染MCF-7細胞，通過綠色熒光蛋白GFP檢測轉染效率。使用嘌呤霉素進行加壓篩選，獲得穩(wěn)定高表達MTDH基因的新的乳腺癌細胞株（命名為 MCF-7-MTDH）和陰性對照病毒穩(wěn)定轉染的乳腺癌細胞株（命名為MCF-7-vector）。采用RT-PCR方法分別檢測空白對照組（ MCF-7細胞）、陰性對照組（ MCF-7-vector細胞）、實驗組（MCF-7-MTDH細胞）的MTDH

3、 mRNA表達水平驗證轉染效果。
　　2.CCK法檢測細胞增殖及對紫杉醇的敏感性：以MCF-7作為空白對照，以MCF-7-vector作為陰性對照，檢測MTDH高表達對MCF-7細胞增殖和對紫杉醇藥物敏感性的影響。
　　3.流式細胞術檢測細胞周期及紫杉醇對細胞周期的影響：以 MCF-7作為空白對照，以MCF-7-vector作為陰性對照，檢測MTDH高表達對細胞周期的影響，并檢測紫杉醇藥物對細胞周期的影響。
　　4.統(tǒng)

4、計分析：每組實驗至少有3個獨立樣本的重復，應用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析。數(shù)據用均數(shù)±標準差（ x±s）表示，進行t檢驗(t-test)、單因素方差分析（analysis of variance, ANOVA）或非參數(shù)檢驗(Nonparametric test)，檢驗以P<0.05為差異有顯著性意義。
　　結果：
　　1.慢病毒介導高表達MTDH乳腺癌穩(wěn)轉細胞株的構建和鑒定
　　MCF-7細胞MO

5、I值檢測：顯微鏡下觀察慢病毒感染后細胞綠色熒光蛋白GFP表達情況，實驗結果顯示乳腺癌MCF-7細胞的MOI（Multiplicity Of Infection，MOI）值為20，即細胞感染效率達到80％，且細胞形態(tài)在感染前后無明顯改變。
　　高表達 MTDH的 MCF-7穩(wěn)轉細胞株的構建與鑒定：慢病毒感染MCF-7細胞72h后，通過熒光顯微鏡觀察 MCF-7-MTDH實驗組和MCF-7-vector對照組均可見綠色熒光蛋白表達，轉

6、染效率都超過80%。經嘌呤霉素加壓篩選獲得穩(wěn)定轉染的 MCF-7-MTDH細胞株和MCF-7-vector細胞株。通過RT-PCR檢測MCF-7細胞、MCF-7-vector細胞、MCF-7-MTDH細胞中 MTDH基因 mRNA表達水平分別為1.000±0.100、1.013±0.169、2.093±0.055。統(tǒng)計分析結果顯示MCF-7細胞與MCF-7-vector細胞MTDH基因mRNA表達未見明顯差異（P＞0.05）， MCF-

7、7-MTDH細胞 MTDH基因 mRNA表達高于 MCF-7細胞、MCF-7-vector細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.MTDH高表達對細胞增殖和細胞周期的影響
　　將MCF-7、MCF-7-vector、MCF-7-MTDH三種細胞分別作為空白對照組、陰性對照組和實驗組。
　　CCK法檢測各組細胞于0h、24h、48h、72h的增殖情況，統(tǒng)計分析顯示空白與陰性對照兩組細胞增殖未見明顯差異（ P＞0

8、.05），實驗組MCF-7-MTDH細胞增殖快于對照兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　流式細胞儀檢測各組的細胞周期，結果顯示空白對照組、陰性對照組、實驗組細胞 G0/G1期的比例分別為32.90±1.48%、34.70±1.65%、28.80±1.21%；S期比例分別為43.40±0.95%、40.37±3.61%、57.60±2.10%；G2/M期的比例分別為23.67±0.80%、23.60±2.51%、13.57

9、±2.11%。統(tǒng)計分析結果顯示空白及陰性對照組的細胞周期無顯著差異（P＞0.05），而與對照對相比實驗組細胞S期延長，G0/G1期和G2/M期縮短（P＜0.05）。
　　3.紫杉醇對轉染前后乳腺癌細胞增殖和周期的影響
　　將MCF-7、MCF-7-vector、MCF-7-MTDH三種細胞分別作為空白對照組、陰性對照組和實驗組。
　　CCK法檢測1ug/ml紫杉醇作用24h對三組細胞的抑制率分別為63.71±0.31%

10、、64.15±0.17%、45.72±0.41%；1ug/ml紫杉醇作用48h對三組細胞的抑制率分別為37.46±0.17%、37.10±0.14%、25.90±0.31%；10 ug/ml紫杉醇作用24h對三組細胞的抑制率分別為71.11±0.87%、72.55±0.68%、66.97±0.84%；10 ug/ml紫杉醇作用48h對三組細胞的抑制率分別為69.95±0.43%、70.77±0.21%、59.95±0.53%，統(tǒng)計分析結

11、果顯示在藥物濃度、作用時間都相同條件下空白及陰性對照組的紫杉醇抑制率未見明顯差異（ P＞0.05）。1ug/ml、10ug/ml紫杉醇作用24h和48h后對實驗組MCF-7-MTDH細胞的抑制率均低于兩對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。空白對照組細胞10ug/ml紫杉醇作用24h和48h后抑制率未見明顯差異（P＞0.05），其余各組紫杉醇作用48h后抑制率較24h降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　流式細胞儀檢測

12、紫杉醇用藥后各組的細胞周期，統(tǒng)計分析結果顯示：紫杉醇藥物誘導各組細胞G2/M期比例增高，10ug/ml用藥組較1ug/ml用藥組增高更加明顯（ P＜0.05）；藥物濃度相同的情況下， MCF-7、MCF-7-vector細胞的 G2/M期比例無顯著差異（ P＞0.05），而MCF-7-MTDH細胞的G2/M期比例低于MCF-7、MCF-7-vector細胞，有顯著性差異（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.通過慢病毒介導成