缺氧環(huán)境下shRNA下調(diào)MTDH基因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞增殖及凋亡的影響.pdf

1、研究背景和意義:大量的研究表明,腫瘤周圍微環(huán)境可引起腫瘤細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定,缺氧是惡性腫瘤微環(huán)境的重要特征。在缺氧環(huán)境下,部分腫瘤細(xì)胞基因組發(fā)生改變而呈現(xiàn)出更強(qiáng)的生存和侵襲能力,其中缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF-1α)起主要調(diào)控作用。缺氧環(huán)境下,HIF-1α對促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的代謝、新生血管的形成和促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及誘發(fā)腫瘤細(xì)胞耐藥等起重要作用,其表達(dá)水平與腫瘤不良預(yù)后呈正相關(guān)。
　　乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。轉(zhuǎn)移

2、粘附基因(metadherin,MTDH),在正常乳腺組織、乳腺增生組織中低表達(dá)或不表達(dá),然而在乳腺癌組織中高表達(dá),其與乳腺癌惡性生物學(xué)行為呈正相關(guān)。已有研究證實,過表達(dá)的MTDH基因可以促進(jìn)HIF-1α的表達(dá);另外的研究也表明,利用siRNA干擾HIF-1α后,MTDH表達(dá)也隨之降低。研究者們推測MTDH與HIF-1α形成了一個相互調(diào)控的正反饋環(huán),提示MTDH基因在缺氧環(huán)境下對促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為可能起到重要的作用。因此,探索

3、MTDH基因在缺氧環(huán)境下對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控作用,可幫助人們進(jìn)一步理解缺氧微環(huán)境對乳腺癌細(xì)胞造成的影響。
　　本研究采用氯化鈷模擬缺氧微環(huán)境,通過shRNA下調(diào)MTDH基因表達(dá),觀察人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系在增殖及凋亡方面生物學(xué)行為的變化,以及相關(guān)分子表達(dá)水平的改變,以期初步了解缺氧環(huán)境下MTDH基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞的調(diào)控作用。
　　目的:探討缺氧環(huán)境下MTDH表達(dá)下調(diào)對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　

4、　方法:1.利用氯化鈷模擬缺氧環(huán)境,采用RT-PCR及Western blot檢測HIF-1α及MTDH基因在缺氧環(huán)境下表達(dá)水平的改變;2.將MTDH基因的干擾質(zhì)粒MTDH-shRNA和陰性對照質(zhì)粒Control-shRNA分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后觀察轉(zhuǎn)染效率,應(yīng)用RT-PCR及Western blot檢測MTDH基因在mRNA和蛋白水平上的變化,驗證沉默效果;3.MTT實驗檢測下調(diào)MTDH基因表達(dá)后對缺氧環(huán)境下MCF-7細(xì)

5、胞增殖的影響,Hoechst33258染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的情況;4.RT-PCR及Western blot檢測HIF-1α在mRNA和蛋白水平上的變化,觀察下調(diào)MTDH基因?qū)IF-1α表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:1.在氯化鈷模擬缺氧環(huán)境下,MCF-7細(xì)胞HIF-1αmRNA表達(dá)水平無變化,HIF-1α蛋白表達(dá)水平在一定范圍內(nèi)隨缺氧時間延長而升高,MTDH mRNA及蛋白表達(dá)水平均逐漸升高;2.轉(zhuǎn)染效率達(dá)70％,MTDH-s