Stra8在精子發(fā)生中作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、Stra8基因是一個(gè)生殖腺特異性表達(dá)基因，其表達(dá)受到視黃酸(Retinoic acid，RA)的調(diào)控。Stra8基因敲除后雄性小鼠失去生育能力，精子發(fā)生阻滯在減數(shù)分裂階段，此過(guò)程中Stra8的作用機(jī)制尚未闡明。為了進(jìn)一步探究Stra8在精子發(fā)生中的分子機(jī)制，本論文從以下三個(gè)部分展開(kāi)了實(shí)驗(yàn)研究。
　　第一部分:精子發(fā)生中Stra8下游作用基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的初步研究
　　目的:
　　探索Stra8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制，找尋

2、其可能的下游作用基因，研究其下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　方法:
　　將Stra8.KO雜合型（Stra8+/-）小鼠合籠，收集子代純合型（Stra8-/-）和野生型（Stra8+/+）小鼠。取出生后5天～12天小鼠，制不同日齡睪丸組織切片，HE染色，觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)。用生精細(xì)胞標(biāo)志物Ddx4對(duì)不同日齡小鼠睪丸組織行免疫組織化學(xué)熒光染色，并對(duì)陽(yáng)性生精細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。選取出生后11天Stra8-/-和Stra8+/+小鼠睪丸組

3、織進(jìn)行RNA-Sequnce，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)RNA-Sequnce中表達(dá)有差異的基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　出生后不同日齡小鼠，5～11天Stra8-/-和Stra8+/+小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)相似，單個(gè)生精小管內(nèi)生精細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第12天時(shí)，Stra8+/+小鼠生精小管管腔內(nèi)初級(jí)精母細(xì)胞與Stra8-/-小鼠相比明顯增多，且單個(gè)生精小管內(nèi)生精細(xì)胞數(shù)量有顯著性差異。RNA-Sequnce

4、分析發(fā)現(xiàn)了96個(gè)RNA在Stra8敲除后表達(dá)量有顯著性差異，其中40個(gè)RNA表達(dá)下調(diào)，56個(gè)RNA表達(dá)上調(diào)。對(duì)其中21個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些RNA的表達(dá)水平與RNA-Sequnce結(jié)果相一致。
　　結(jié)論:
　　應(yīng)用RNA-Sequnce等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了96個(gè)Stra8基因敲除后差異表達(dá)的RNA，其中21個(gè)基因可能參與精母細(xì)胞減數(shù)分裂、精原細(xì)胞自我更新及精原細(xì)胞分化等過(guò)程的調(diào)控。Stra8可能通過(guò)調(diào)控上述差異

5、表達(dá)基因，調(diào)節(jié)精子發(fā)生過(guò)程。
　　第二部分:兔抗小鼠Setd8多克隆抗體的制備
　　目的:
　　獲得小鼠Setd8原核蛋白，制備兔抗小鼠Setd8多克隆抗體。
　　方法:
　　將pGADT7-Setd8質(zhì)粒和pET-30a載體分別雙限制性內(nèi)切酶酶切后連接、轉(zhuǎn)化和鑒定，構(gòu)建pET-30a-Setd8原核表達(dá)質(zhì)粒。將pET-30a-Setd8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過(guò)鎳親和

6、層析柱蛋白純化。用純化的Setd8蛋白免疫新西蘭大白兔，獲得Setd8多克隆抗體。應(yīng)用ELISA、Western blot及免疫組織化學(xué)法對(duì)Setd8多克隆抗體進(jìn)行效價(jià)測(cè)定及特異性鑒定。
　　結(jié)果:
　　限制性內(nèi)切酶雙酶切法及序列測(cè)定法表明:pET-30a-Setd8重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。IPTG誘導(dǎo)后，大腸桿菌可高效表達(dá)Setd8原核蛋白。獲得的Setd8多克隆抗體經(jīng)ELISA檢測(cè)，效價(jià)為1∶1000000。Western b

7、lot結(jié)果顯示:Setd8多克隆抗體能特異性識(shí)別細(xì)胞中的Setd8蛋白。免疫組織化學(xué)法顯示:Setd8主要表達(dá)在成年小鼠睪丸組織中的精原細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　成功獲得較高純度Setd8蛋白，制備的Setd8多克隆抗體具有較高反應(yīng)性和特異性。
　　第三部分:成年小鼠睪丸內(nèi)精原細(xì)胞及精母細(xì)胞的純化
　　目的:
　　建立一個(gè)簡(jiǎn)便、高效的成年小鼠睪丸精原細(xì)胞、精母細(xì)胞純化方法。
　　方法:
　　運(yùn)用酶

8、消化法將成年小鼠睪丸制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)9層非連續(xù)Percoll密度梯度（17％、22％、25％、28％、31％、34％、37％、40％和90％）離心法分離，通過(guò)組織學(xué)染色和計(jì)數(shù)法確定精原細(xì)胞及精母細(xì)胞的純度。
　　結(jié)果:
　　酶消化后所得睪丸單細(xì)胞懸液經(jīng)Percoll密度梯度離心，共形成9條細(xì)胞帶，其中22％密度梯度中主要為精子細(xì)胞;而31％、34％及37％密度梯度中主要為精原細(xì)胞及精母細(xì)胞，且純度較高，達(dá)71.50％。<