Stra8基因克隆表達及其功能的初步研究.pdf

1、胚胎干細胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是具有高度未分化、自我更新及分化為包含生殖細胞在內(nèi)的成體器官及組織的全能性細胞。研究和利用ESCs是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域的熱點及核心問題之一。雞胚胎干細胞(chicken Embryonic Stem Cells，cESCs)是從新鮮雞X期胚盤明區(qū)分離獲得的細胞，此時胚盤約有6萬個細胞，它們可在體外特定的培養(yǎng)基中保持多能性和全能性，這為研究早期胚胎發(fā)育及分化提供了優(yōu)良的模型。近

2、年來，已有很多關(guān)于不同方法體外誘導(dǎo)ESCs分化為生殖細胞的報道，其中利用視黃酸(Retinoid Acid,RA)進行誘導(dǎo)較為常見，這可能是因為RA在胚胎干細胞誘導(dǎo)及細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用，它能直接進入細胞核內(nèi)，與其受體結(jié)合后作用于靶基因，從而調(diào)控胚胎發(fā)育及組織形成。并且由RA激活的基因Stra8(Stimulated by Retinoid acid Gene8)的表達是生殖細胞進行減數(shù)分裂的關(guān)鍵。目前，有關(guān)該基因的研究主要集中在小

3、鼠等模式生物以及人和一些哺乳動物方面，對于禽類該基因的研究較少，且有關(guān)該基因?qū)τ谏臣毎麥p數(shù)分裂的作用機制尚未闡明。
　　本研究采用RT-PCR方法克隆出蘇禽黃雞睪丸組織中Stra8基因序列，生物信息學(xué)分析有關(guān)該基因亞細胞定位、蛋白二級結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1(+)-Stra8、質(zhì)粒純化后免疫小鼠制備多克隆抗體，采用增強型熒光蛋白(enhanced fluorescentprotein，EGFP)及制備的多

4、克隆抗體驗證該基因亞細胞定位，用RA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-Stra8的雞胚胎干細胞向生殖細胞分化，采用qRT-PCR及間接免疫熒光檢測誘導(dǎo)過程中特定基因的表達變化情況。主要研究結(jié)果如下:
　　克隆蘇禽黃雞Stra8基因的cDNA序列全長645bp，共編碼214個氨基酸，其中堿性氨基酸12個、酸性氨基酸47個以及60個疏水性氨基酸和66個極性氨基酸。將序列提交至GenBank獲得登錄號:JX204292.1。經(jīng)過預(yù)測該基因定位于

5、細胞質(zhì)，蛋白大小為24.3kDa，等電點為4.2，其序列與原雞Stra8的氨基酸序列同源性高達99％，和火雞的為95％，與斑胸草雀的為76％，和一些靈長類、哺乳動物以及嚙齒類動物同一性在40-55％之間，和其他物種的同源性較差，上述結(jié)果說明Stra8在禽類中保守性較好。
　　構(gòu)建pEGFP-C1-Stra8及pcDNA3.1(+)-Stra8真核表達載體，純化質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Stra8免疫小鼠制備Stra8抗體，效價檢

6、測結(jié)果為1∶100。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-C1-Stra8轉(zhuǎn)染NIH-3T3細胞及間接免疫熒光進行亞細胞定位。結(jié)果表明，Stra8蛋白定位于細胞質(zhì)，與預(yù)測結(jié)果相符合。通過提取轉(zhuǎn)染48后細胞總RNA及蛋白進行RT-PCR及Western Blot檢測重組質(zhì)粒在NIH-3T3細胞中的整合情況。結(jié)果表明，外源Stra8基因在mRNA水平上發(fā)生轉(zhuǎn)錄，在蛋白水平上發(fā)生融合表達。上述結(jié)果為建立穩(wěn)定表達的細胞系及研究禽類Stra8蛋白表達

7、及其功能發(fā)揮奠定了基礎(chǔ)。
　　采用藥勺法獲取雞X期胚盤，吹散胚盤以1×105/孔接種入24孔板內(nèi)進行培養(yǎng)。摸索重組質(zhì)粒pEGFP-C1-Stra8轉(zhuǎn)染cESCs的最適用量，并使用G418進行篩選，所得細胞經(jīng)挑克隆及酶消化聯(lián)合法傳代培養(yǎng)。結(jié)果表明，使用1.2μg的質(zhì)粒量可獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)G418篩選2w所得細胞再用1×10-5mol/L的RA進行誘導(dǎo)，并設(shè)置3組對照。qRT-PCR檢測Sox2、Dazl、Stra8及integ