五龍鵝MHCⅠ基因克隆、組織表達及分子特性的研究.pdf

1、主要組織相容性復合體(Majorhistocompatibilitycomplex,MHC)是由緊密連鎖的高度多態(tài)的基因位點所組成的位于染色體上一個遺傳區(qū)域，廣泛存在于所有脊椎動物，具有高度的多態(tài)性和保守性。該基因區(qū)編碼的蛋白通常稱為MHC分子或MHC抗原，是移植排斥的主要決定簇。根據結構和功能可將MHC分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類。在結構上Ⅰ類分子可分成肽結合區(qū)、Ig樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)4個部位。國內外關于鵝免疫方面的研究較少，本試驗以我國優(yōu)良

2、的地方品種——五龍鵝為試驗對象，主要研究五龍鵝MHCclassⅠ基因分子特性，獲得如下研究結果： 1根據GenBank中雞(XM424372)，鼠(AY064389)，斑馬魚(BC066745)等的MHCclassⅠ基因保守序列，使用PrimerPremier5.0與Oligo6.0程序設計一對引物，利用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)從有絲分裂原刀豆蛋白A(ConA)刺激18h活化的五龍鵝脾細胞中擴增出相應大小的基因，

3、經酶切鑒定和PCR鑒定，將目的片段與pAT2載體連接，轉化到DH5α感受態(tài)中，提取質粒，對序列進行測定，擴增出1062bp的基因，將測得的序列遞交到GenBank中，獲得登陸號為：AM114925。 2根據測得的基因cDNA序列，重新設計引物，提取基因組DNA，利用LA-PCR方法從五龍鵝基因組DNA中克隆了MHCclassⅠ類分子的基因組序列并分析其基因組結構，經過酶切鑒定和PCR鑒定，獲得五龍鵝的基因組MHCclassⅠ序

4、列，共有2594bp個堿基，將測得的序列遞交到GenBank中，獲得登陸號為：AM114924。利用ContigExpress生物軟件和VecScreen程序比較五龍鵝MHCclassⅠ的DNA序列和cDNA序列，發(fā)現鵝MHCclassⅠ含有8個外顯子和7個內含子。 3用TaqMan技術建立了一種實時Realtime-PCR的方法，用于檢測鵝MHCclassⅠ基因，無菌采取鵝心肝、脾，肺、腎、胸腺、法氏囊、腦、肌肉和胚胎組織，

5、進行實時Realtime-PCR，該方法具有較好的敏感性和特異性，試驗結果發(fā)現：MHCclassⅠ基因在鵝的組織中按不同的表達量關系為：法氏囊＞脾臟＞胸腺＞腦＞肺＞肌肉＞腎＞心?。九咛ィ靖?，通過結果可發(fā)現免疫器官中MHCclassⅠ基因的表達量要比其它器官的高。 4運用生物信息學的方法進一步分析了五龍鵝MHCclassⅠ基因核酸序列及氨基酸序列(編號WLMHCclassⅠ)。核酸DNA序列基因酶切圖譜分析獲得21種常見限制性內

6、切酶的酶切位點；WLMHCclassⅠ蛋白分子量為39074.69m.w，等電點pI為5.53；蛋白的疏水性為3.433，在第300-320氨基酸的C端有一段較強的疏水區(qū)；有兩個蛋白質超家族，有44.4％的可能存在于線粒體內。三維結構中由兩個長的α-螺旋，三個β-折疊構成，α-螺旋之間形成一個空間凹陷。與其他16個物種的氨基酸序列多序列比對的進化樹，表明鵝MHCclassⅠ與雞有64.1％的同源性，與鼠有43.5～44.4％的同源性，與