microRNA在骨髓間質(zhì)干細胞介導(dǎo)的急性腎損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、目的：探討大鼠骨髓間質(zhì)干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，rMSCs)在順鉑誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷(acutekidneyinjury，AKI)中通過調(diào)控關(guān)鍵microRNA(miRNA)的表達從而發(fā)揮修復(fù)作用。骨髓間質(zhì)干細胞(rMSCs)移植AKI大鼠，觀察rMSCs對損傷腎的修復(fù)作用;miRNA芯片比較篩選出在rMSCs組與PBS組中表達差異的miRNAs分子，體內(nèi)外實驗驗證并探尋rMSCs修復(fù)腎損傷

2、中的關(guān)鍵miRNAs，揭示rMSCs修復(fù)腎損傷的可能分子機制。
　　 方法：以6mg/kg劑量的順鉑經(jīng)腹腔注射到大鼠體內(nèi)，建立急性腎損傷實驗動物模型。于順鉑注射后的24h以尾靜脈注射方式將2×106rMSCs輸注到大鼠體內(nèi)，并分別在損傷不同時間點收集大鼠的血液，檢測血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平來評價MSC對腎功能的改善情況，通過活體成像觀察rMSCs的組織定位。于順鉑注射后5d處死大鼠，留取腎組織標(biāo)本，HE染色觀察rMS

3、Cs對腎組織的修復(fù)作用，WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達，免疫組織化學(xué)染色檢測增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，TUNEL染色檢測腎小管上皮細胞的凋亡情況，綜合評價間質(zhì)干細胞對急性腎損傷的修復(fù)作用。在此基礎(chǔ)上，留取正常大鼠（對照組），急性腎損傷輸注PBS大鼠（PBS組）以及輸注rMSCs的大鼠（rMSCs組）的腎組織進行microRNA芯片分析。經(jīng)芯片比較篩選，選取rMSCs組與PBS組差異顯著的miRNAs分子，經(jīng)qRT-

4、PCR檢測并驗證這些miRNAs分子在體內(nèi)外模型中的表達情況。在體內(nèi)外模型中差異變化一致的miRNAs，進一步研究其下游靶基因及相關(guān)信號通路，探討rMSCs修復(fù)腎損傷中可能的分子機制。
　　 結(jié)果：體內(nèi)活體成像結(jié)果顯示經(jīng)尾靜脈注射的rMSCs能夠到達損傷的大鼠腎組織，rMSCs移植組的BUN、Cr水平較PBS組有明顯的下降(P＜0.05)，病理HE染色結(jié)果顯示rMSCs移植組的腎組織結(jié)構(gòu)比較完整、蛋白管型減少，免疫組織化學(xué)與TU

5、NEL染色結(jié)果揭示rMSCs能顯著增加損傷部位的腎小管上皮細胞的增殖，減少腎小管上皮細胞的凋亡，WesternBlot顯示rMSCs移植組的Bax表達下調(diào)，Bc1-2的表達上調(diào)。microRNA芯片分析顯示部分miRNAs分子在PBS組較正常對照組的表達顯著增高或降低，而rMSCs可以逆轉(zhuǎn)相應(yīng)miRNAs分子的表達。選取miR-92b，miR-146b，miR-150*與miR-455進行驗證，qRT-PCR驗證結(jié)果顯示miR-146b

6、在體內(nèi)外模型中變化一致且與芯片結(jié)果相符，初步選取miR-146b進行體外功能實驗。WesternBlot進一步檢測了miR-146b的靶基因表皮生長因子受體(EGFR)在各組中的表達，結(jié)果顯示在PBS組由于miR-146b高表達，EGFR的表達較低，而rMSCs降低了miR-146b的表達，導(dǎo)致EGFR蛋白表達增加，從而調(diào)控其下游Akt相關(guān)蛋白通路，在腎損傷中發(fā)揮修復(fù)作用。
　　 結(jié)論：rMSCs的移植對急性腎損傷具有修復(fù)作用，