骨橋蛋白的原核表達、純化及生物學活性研究.pdf

1、目的：骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是細胞外基質中一種重要的功能性蛋白，可由多種組織細胞合成與分泌。近年來的研究表明，OPN作為機體反應性蛋白，在機體炎癥、組織損傷與修復等病理過程中具有重要的功能和作用。在心血管系統(tǒng)中，OPN 通過與血管內(nèi)皮和平滑肌細胞(VSMC)表面的整合素受體相互作用而介導細胞黏附和遷移，進而參與血管內(nèi)皮損傷所導致的內(nèi)膜增生的發(fā)生與發(fā)展過程。為了研究OPN誘導VSMC黏附和遷移的分子機制及其在血管內(nèi)膜增

2、生中的作用，制備OPN是必要的。為此，本實驗利用基因重組技術，將OPN cDNA與攜帶GST 編碼序列的原核表達載體進行重組后，在大腸桿菌中表達得到GST-OPN融合蛋白，為進一步研究該蛋白在血管內(nèi)膜增生中的作用奠定了基礎。 方法： 1、OPN原核表達質粒的構建 將OPN cDNA片段克隆入pGEX-4T-1原核表達載體，構建pGEX-4T-1-OPN質粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶圖譜和DNA序列分析對重組質粒進行鑒

3、定。 2、GST-OPN融合蛋白在大腸桿菌中的表達 2.1 GST-OPN融合蛋白的誘導表達 將pGEX-4T-1-OPN轉化大腸桿菌后，對IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度進行篩選優(yōu)化，確定GST-OPN融合蛋白誘導表達的最佳條件。在最佳條件下對pGEX-4T-1-OPN轉化菌進行誘導培養(yǎng)后，將菌體裂解后離心，分別收集上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE檢查融合蛋白在細胞中的存在形式。 2．2 GST

4、-OPN融合蛋白的分離純化 菌體經(jīng)裂解及離心后取上清，用GST-Sepharose 4B親和層析對GST-OPN融合蛋白進行純化。 3、GST-OPN融合蛋白生物學活性檢測 3．1細胞黏附實驗 將傳代的VSMC接種到用OPN包被的96孔板中，檢測單位時間內(nèi)黏附至孔板上的細胞數(shù)，以此表示細胞黏附活性。以從VSMC培養(yǎng)基中提取的天然OPN和GST蛋白作為平行對照，以確定GST-OPN促進細胞黏附的特異

5、性。 3．2傷口愈合實驗 細胞傳代時，將VSMC接種于帶有玻片的孔板內(nèi)，細胞生長至100％匯合后，用無菌吸頭在玻片上劃痕。PBS洗凈刮下的細胞，將玻片放回孔板內(nèi)，每孔加入23 mg/LGST-OPN，繼續(xù)孵育24 h后，于低倍鏡下觀察細胞傷口愈合程度，以此表示細胞的遷移活性。以從VSMC培養(yǎng)基中提取的天然OPN和GST蛋白作為平行對照，以確定GST-OPN促進細胞遷移的特異性。 結果： 1、重組質

6、粒pGEX-4T-1-OPN的構建 以含有OPN cDNA序列的重組質粒OP10(DrLarryFisher惠贈)為模板進行PCR擴增得到的OPN cDNA片段與pGEX-4T-1載體連接得到重組表達質粒。重組質粒經(jīng)Bam H I/Xho I雙酶切后進行電泳鑒定時出現(xiàn)長度為860 bp左右的插入片段，與預期結果相一致。測序分析結果與GeneBank 收錄的OPN cDNA序列進行比對，證明插入片段的序列是正確的。

7、2、GST-OPN融合蛋白的誘導表達 轉化pGEX-4T-1-OPN的宿主菌經(jīng)IPTG誘導后可表達分子量約75 kD的蛋白質。在培養(yǎng)物OD<,600>=1.5時按1：50的比例接種于含0.1 mmol/IPTG的LB培養(yǎng)液中，25℃誘導培養(yǎng)6 h的條件下， GST-OPN融合蛋白的表達量在菌體蛋白中所占比例最大，融合蛋白主要以可溶性形式存在。此條件作為GST-OPN 融合蛋白誘導表達的最佳條件。 3、GST-OPN融

8、合蛋白的分離純化 轉化pGEX-4T-1-OPN的宿主菌在最佳條件下被誘導培養(yǎng)后，離心收集菌體，用PBS(pH 7.3)重懸后加NaOH調pH值為8.0，以達到溶菌酶發(fā)揮作用的最適pH，用溶菌酶室溫消化后加Triton X-100以防止蛋白交聯(lián)。離心收集上清，加谷胱甘肽瓊脂糖珠共孵育，經(jīng)PBS洗滌4-5次后，用還原型谷胱甘肽洗脫液進行數(shù)次洗脫，合并收集的洗脫液。取適量洗脫液進行SDS-PAGE，結果可見清晰的單一的75 kD蛋

9、白條帶，說明經(jīng)親和層析純化的GST-OPN 已達電泳純。100 ml培養(yǎng)物經(jīng)親和層析純化后，得到約3 mg可溶性GST-OPN融合蛋白。 4、GST-OPN融合蛋白對VSMC黏附的影響 本研究觀察重組GST-OPN融合蛋白對細胞黏附的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，GST-OPN融合蛋白能夠顯著促進VSMC的黏附，其作用與天然OPN相比無統(tǒng)計學差異。平行對照中的GST蛋白不影響VSMC的黏附。 5、GST-OPN融合蛋白

10、對VSMC遷移的影響 VSMC遷移是由細胞與細胞外基質及多種細胞因子相互作用所介導的。細胞外基質中的OPN作為整合素的主要配體在VSMC遷移中發(fā)揮重要作用。本實驗研究重組OPN對細胞遷移的影響，與黏附實驗分組相同。結果發(fā)現(xiàn)，GST-OPN可明顯促進細胞的遷移，其作用與天然OPN 相比無統(tǒng)計學差異，平行對照實驗中的GST蛋白對VSMC的遷移沒有影響。 結論： 1、成功構建了含有OPN基因序列的pGEX-4T-

11、1-OPN原核表達質粒。 2、經(jīng)過對IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間等條件進行優(yōu)化，25℃條件下用0.1 mmol/L IPTG誘導6 h，GST-OPN融合蛋白在大腸桿菌中得到有效表達。 3、菌體經(jīng)裂解及離心后取上清，經(jīng)GST-Sepharose 4B親和層析得到電泳純的GST-OPN融合蛋白。 4、GST-OPN融合蛋白能顯著促進VSMC黏附。 5、GST-OPN融合蛋白能顯著促進VSMC遷移