火菇素cDNA基因的原核表達(dá)與重組蛋白的純化及活性研究.pdf

1、火菇素是一種具有抗癌活性的典型的食用菌蛋白類(lèi)藥物，由日本人KomatsuN.等(1963)首先從金針菇中分離出來(lái)?；鸸剿貙?duì)小鼠肉瘤S180和艾氏腹水瘤有明顯的抑制作用，且能延長(zhǎng)小鼠的生存期。在火菇素的作用下，腫瘤細(xì)胞發(fā)生了明顯的病理變化：細(xì)胞的有絲分裂受到抑制，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中形成空泡，使細(xì)胞膨脹破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解。毒性實(shí)驗(yàn)研究表明，火菇素對(duì)生物機(jī)體無(wú)明顯的毒副作用。 本論文的主要工作在于火菇素cDNA基因的原核表達(dá)，重組

2、蛋白的純化及活性的研究。由于常規(guī)提取火菇素工作量大、周期長(zhǎng)、得率低，故而阻礙了其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。利用大腸桿菌高效表達(dá)火菇素蛋白能很好的解決了進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床藥理實(shí)驗(yàn)研究的原料問(wèn)題。而檢測(cè)基因工程菌表達(dá)的蛋白同樣具有抑瘤活性是進(jìn)一步證明可替代常規(guī)提取的火菇素。 將火菇素cDNA基因序列擴(kuò)增，用雙酶切法將其插入到原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL2l(DE3)中，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切、DNA測(cè)

3、序等鑒定，用10％的甘油保存在-20℃冰箱中。用終濃度為1mmol/L的IPTG在30℃誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。通過(guò)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳發(fā)現(xiàn)在分子量約為38 000Da處有一新生蛋白質(zhì)條帶，即火菇素重組蛋白。實(shí)驗(yàn)表明重組蛋白以可溶和不可溶兩種形式存在于大腸桿菌中。將大腸桿菌進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，離心，分別收集上清液和包涵體。將上清液穿過(guò)Ni<'+>NTA his bind resin，通過(guò)組氨酸和金屬鎳的特異親和特性，將目的蛋白掛在柱上，增加緩沖

4、液中的咪唑濃度再洗脫目的蛋白，達(dá)到純化的目的。用West blot實(shí)驗(yàn)證明重組蛋白能與天然火菇素制備的家兔血清免疫結(jié)合。將包涵體用低濃度的尿素洗滌，然后用高濃度的尿素完全溶解之，再次高速離心，將上清液穿過(guò)Ni<'+>-NTA his bind resin，通過(guò)改變層析柱的pH值達(dá)到分離純化變性蛋白的目的。收集的洗脫峰采用尿素濃度梯度透析復(fù)性。 將火菇素重組蛋白作用于人急性單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞株U937，用倒置顯微鏡、普通光學(xué)顯微

5、鏡、激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)重組蛋白作用下的腫瘤細(xì)胞的形態(tài)特征和細(xì)胞周期。通過(guò)將終濃度20μg/ml的火菇素重組蛋白加入到U937細(xì)胞培養(yǎng)液中，作用24h后，收集細(xì)胞、洗滌、70％乙醇固定、PI(姬姆薩)染色、鏡檢，上流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果表明，用倒置相差顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡以及激光共聚焦顯微鏡觀察，均能觀察到凋亡細(xì)胞的特征，給藥組與對(duì)照組有很大的區(qū)別。結(jié)果說(shuō)明火菇素重組蛋白能夠促進(jìn)U937腫瘤細(xì)胞的凋亡，和天然火菇素一樣有抗癌