IER5原核表達載體的構(gòu)建及融合蛋白表達、純化.pdf

1、IER5為Immediate Early Response gene 5基因的簡稱，是早期反應(yīng)基因家族中的一員。經(jīng)檢索國內(nèi)外文獻獲悉，目前人們對IER5基因研究不是很多，現(xiàn)有的研究顯示IER5基因表達變化對細胞周期和細胞凋亡具有調(diào)節(jié)作用，參與了細胞對促有絲分裂信號反應(yīng)的調(diào)節(jié)。我們前期研究結(jié)果顯示：輻射后淋巴母細胞(AHH-1)、宮頸癌(Hela)細胞和肝癌(HepG2)細胞的IER5基因表達上調(diào)；抑制IER5基因表達，Hela和HepG

2、2細胞增殖變快，細胞對輻射的拮抗性增強，輻射敏感性減弱，且IER5基因沉默Hela細胞體積比正常腫瘤細胞大；與之相反，增加IER5表達，Hela和HepG2細胞增殖減慢，且IER5基因高表達Hela細胞尺寸明顯小于正常腫瘤細胞、輻射后凋亡比例增大，IER5高表達細胞的抗輻射能力減弱，輻射敏感性增強。這些研究提示我們IER5基因與肝癌、宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，參與了細胞周期的調(diào)控，可能類似于抑癌基因的功能。這些研究結(jié)果提示我們有必要對IE

3、R5基因展開更深入的研究，進一步闡明該基因的生物學(xué)功能，有可能為腫瘤放療尋找到新的輻射敏感基因，以提高臨床腫瘤放療效果。
　　 IER5為沒有內(nèi)含子的基因，整個cDNAGC含量為60.5％（開放閱讀框架為71.7％），在PCR過程成中形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，給人工合成IER5融合蛋白和單克隆抗體帶來難度。單克隆抗體具有易于制備、理化性質(zhì)均一、生物活性單一、特異性強、易于標(biāo)準化等優(yōu)點。使用單克隆抗體，能提高免疫學(xué)檢驗和臨床治療的特異性

4、和準確性，對生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域有著重要的意義[13]。目前市場只有IER5多克隆抗體，在用于蛋白質(zhì)免疫沉淀實驗中與IER5相互作用蛋白和Western-blot實驗中IER5蛋白的檢測時效果不佳，這給進一步研究IER5基因的生物學(xué)功能帶來困難，因此本課題組決定制備IER5單克隆抗體，合成IE5融合蛋白是制備IER5單克隆抗體的關(guān)鍵一步，由于研究時間有限，本研究擬采用Real-timePCR、SDS-PAGE、Western

5、blot等方法制備大量重組IER5融合蛋白，為制備IER5單克隆抗體做準備，為進一步深入研究IER5基因在肝癌等腫瘤輻射治療中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 目的：本課題采用PCR、SDS-PAGE、Western blot等方法，通過誘導(dǎo)表達、超聲破碎、變性、復(fù)性、過NI-NTE鎳柱、透析、聚乙二醇濃縮等實驗技術(shù)純化蛋白以獲得大量IER5重組融合蛋白，為IER5單克隆抗體制備做準備。
　　 方法：人工合成IER5基因，將該基因

6、轉(zhuǎn)入原核表達載體pET22b(+)和pGEx-5T中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，進行測序分析。測序正確后，提取質(zhì)粒，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21(DE3)。即構(gòu)建原核pET22b(+)-IER5、pGEx-5T-IER5表達載體，通過異丙基2B2D2硫代半乳糖苷(IPTG)在大腸桿菌系統(tǒng)穩(wěn)定地表達融合蛋白pET22b(+)-IER5，利用Western blot和SDS-PAGE檢測pET22b(+)-IER5。應(yīng)用咪唑與融合

7、蛋白競爭地與鎳離子結(jié)合將融合蛋白洗脫下來。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建pET22b(+)-IER5、pGEx-5T-IER5表達載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,篩選陽性克隆將pET22b(+)-IER5誘導(dǎo)表達。確定了其原核表達的關(guān)鍵表達參數(shù)：誘導(dǎo)溫度為37度，誘導(dǎo)時間為4h及IPTG濃度為0.01mmol/l，使之可以在大腸桿菌中穩(wěn)定表達。通過8M尿素變性、HisTrapHP親和層析柱、透析、濃縮等技術(shù)獲得表達產(chǎn)物pET22b(+)-IER5