血小板衍生因子對大鼠膀胱平滑肌細胞TRPC6的調控.pdf

1、前言:
　　膀胱過度活動癥是泌尿外科一種常見疾病。以尿急癥狀為特征的綜合征，常伴有尿頻和夜尿癥狀，可伴或不伴有急迫性尿失禁。美國目前有17％的成人患有膀胱過度活動癥，其患病率隨著年齡上升而增加。膀胱過度活動癥的這些癥狀與膀胱逼尿肌功能異常有著密切關系。雖然目前關于膀胱過度活動癥的發(fā)病機制并不清楚，但是很多證據(jù)都表明與陽離子通道異常有關，某些離子通道在調節(jié)逼尿肌收縮與放松有著重要作用。
　　瞬時受體電位通道是一組非選擇性金屬離

2、子通道，如Na+，Ca2+，Mg2+。TRP通道家族由TRPC，TRPN，TRPV，TRPM，TRPA，TRPP等組成。其中的Ca2+離子在細胞質中有著重要作用，當細胞內游離Ca+濃度上升時會導致相應的肌細胞收縮，反之放松。近年來發(fā)現(xiàn)TRPC通道在調控平滑肌細胞收縮中有著越來越多的重要作用。有報道稱TRPC1與TRPC4在環(huán)磷酰胺誘導的膀胱功能異常中有著重要作用。但是關于TRPC6與膀胱過度活動癥的關系中目前鮮有報道。
　　血小板

3、衍生因子在膀胱受損修復中有著重要作用。血小板衍生因子有著潛在促進膀胱平滑肌細胞有絲分裂，同時也有著調節(jié)輸尿管，三角區(qū)平滑肌細胞增殖作用。血小板衍生因子也能夠促進受損膀胱平滑肌細胞增殖。在生理范圍內，持續(xù)給予膀胱平滑肌細胞機械張力可以使血小板衍生因子及其受體的表達上升，這種現(xiàn)象可能也出現(xiàn)在出口梗阻引起膀胱壁纖維化過程中。這提示了在出口梗阻引起的膀胱過度活動癥中，血小板衍生因子也可以影響著TRPC6的一些作用參與膀胱過度活動癥的發(fā)生發(fā)展。<

4、br>　　血小板衍生因子的大多作用也都與絲裂原活化蛋白激酶通路有關。血小板衍生因子可以通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路誘導多種細胞有絲分裂、增殖和分化。血小板衍生因子同樣可以在呼吸道平滑肌細胞中促進TRPC6的表達。目前并沒有發(fā)現(xiàn)在膀胱平滑肌細胞中血小板衍生因子可以通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路來調控TRPC6的報道。因此我們在膀胱平滑肌細胞中檢測了血小板衍生因子對TRPC6的調控作用。
　　實驗方法:
　　1、細胞培養(yǎng)

5、>　　培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2，培養(yǎng)基成分:DMEM:/F12并且含有10％胎牛血清，細胞培養(yǎng)使用10cm細胞培養(yǎng)皿，正常情況下每2天換液一次，每4天可進行傳代操作。
　　2、Western Blot
　　細胞加入50-80ul1.25X Lysis Buffer。適當抽吸，使原來沉底的細胞與裂解液充分混合。離心20分鐘。取上清液即為細胞總蛋白。電泳及轉膜，使用蛋白定量試劑盒測定每組蛋白濃度，配平后上樣，電泳時間為100

6、min，恒壓120v。電泳結束開始轉膜，TRPC6轉膜條件120mA，100min，β-actin為100mA，60分鐘。轉膜結束后漂洗PVDF膜，5min/次，4次。封閉，TRPC6使用含有5％BSA的TBST封閉70分鐘，β-actin使用含有5％脫脂奶粉的TBST封閉100分鐘。將TRPC6一抗按照1∶500稀釋到工作濃度，將β-actin按照1∶2000稀釋到工作濃度。置于旋轉搖床上，室溫25℃孵育4小時。然后洗滌PVDF膜，5

7、min/次，4次。開始孵育二抗，使用1∶2000將二抗稀釋到工作濃度，室溫25℃孵育1小時后洗滌PVDF膜，5min/次，4次。準備發(fā)光。
　　實驗結果:
　　使用血小板衍生因子處理大鼠膀胱平滑肌細胞后24小時后可以發(fā)現(xiàn)明顯的濃度梯度差異。同樣在時間依賴曲線中，使用30ng/ml血小板衍生因子處理細胞后，可以發(fā)現(xiàn)不同處理時間組TRPC6蛋白濃度差異。表明血小板衍生因子可以增加大鼠膀胱平滑肌細胞中TRPC6的表達。
　　

8、這兩個通路都參與了血小板衍生因子調控TRPC6的表達。另外發(fā)現(xiàn)即使在無血小板衍生因子刺激的條件下，單純抑制p38信號通路與JNK信號通路也能減少TRPC6蛋白的表達。
　　我們使用血管內皮生長因子處理大鼠膀胱平滑肌細胞24小時。結果顯示實驗組TRPC6蛋白表達高于對照組，但是實驗組卻沒有發(fā)現(xiàn)明顯的一個濃度梯度變化。
　　結論:
　　1、血小板衍生因子可以增加大鼠膀胱平滑肌細胞中TRPC6的表達。
　　2、絲裂原活