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1、目的:平滑肌細(xì)胞(Smooth muscle cells,SMCs)及內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)相互影響,并在深靜脈血栓形成的機(jī)化再通中均起著重要的作用,本文建立SMCs與EPCs共培養(yǎng)模型,探討SMCs對(duì)EPCs增殖、分化及合成促血管生成因子和蛋白酶情況。
方法:1.密度梯度離心法獲取SD大鼠來(lái)源的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow-derived mononucle
2、ar cells,BMMNCs),差速貼壁法結(jié)合EPCs專(zhuān)用培養(yǎng)基(EGM-2MV)定向誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行鑒定,Dil與UEA雙染進(jìn)行細(xì)胞鑒定,應(yīng)用CCK-8試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行增殖分析并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn),應(yīng)用血管成形試驗(yàn)檢測(cè)EPCs成血管能力;2.貼壁法培養(yǎng)原代SMCs,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征,免疫熒光技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定;3. Transwell法建立共培養(yǎng)模型,分別于共培養(yǎng)1
3、2h、24h、48h、72h行CCK8法測(cè)細(xì)胞增殖情況;應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)24h組EPCs中VEGF、MMP2、MMP9和vWF基因表達(dá);Western技術(shù)檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)情況。
結(jié)果:1.密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法培養(yǎng)的EPCs純度較高,具有較強(qiáng)的遷移及成血管能力;2.貼壁法培養(yǎng)的SMCs經(jīng)特異性抗體鑒定呈陽(yáng)性;3.在共培養(yǎng)12h及24h時(shí),SMCs促進(jìn)皮祖細(xì)胞的增殖(p<0.05);4.共培養(yǎng)24h組的EPCs
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