牙鲆堿性磷酸酶全基因的克隆、序列分析及5’調控區(qū)功能分析.pdf

1、堿性磷酸酶(ALP)是一種單脂磷酸水解酶，它本身是一種膜結合金屬糖蛋白。ALP由一個多基因家族編碼，目前人和小鼠的ALP基因均已被克隆。根據(jù)基因限位，人和小鼠都有一種組織非特異性ALP(Tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TSNALP)，在肝、腎、骨骼、早期胚胎等組織中表達。另外，人和小鼠還分別有3種和2種組織特異性ALP(tissue-specific alkaline phosphatas

2、e，TSALP)，包括人的腸ALP、胎盤ALP和生殖細胞ALP；小鼠的腸ALP和胚胎ALP。 目前在哺乳動物中關于ALP基因的克隆、生理功能及轉錄調控機制已有很多報道，但水生動物ALP基因的克隆、表達和調控的研究鮮有報道。近幾年本實驗室圍繞著ALP在牙鲆變態(tài)發(fā)育中的作用，開展了一系列工作，研究表明ALP活性的變化明顯影響變態(tài)時期牙鲆仔魚的骨骼細胞的形態(tài)及消化功能。本實驗室通過RACE的方法克隆了牙鲆ALP基因cDNA序列，而且通

3、過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在體內水平甲狀腺激素可以上調ALP的表達。為了確定牙鲆ALP基因的類型、分析基因結構特征，本研究首次在魚類中分離出ALP全基因序列。牙鲆堿性磷酸酶基因全長10kb，含有11個外顯子、10個內含子。11個外顯子的長度分別是69bp、117bp、117bp、174bp、174bp、141bp、69bp、135bp、192bp、84bp、410bp。10個內含子長度分別是1587bp、170bp、356bp、1857

4、bp、91bp、331bp、791bp、1188bp、1209bp、791bp，A／T含量分別是62％、51％、66％、60.04％、51.6％、59.5％、61.6％、59.3％、55.1％、56％，符合內含子A／T含量高的特點。外顯子和內含子的連接符合GT-AG的剪切原則(除了外顯子10)。起始密碼子ATG位于第一個外顯子，ALP活性位點序列位于第4個外顯子。在線軟件預測第一個內含子中兩個位點可能具有啟動子活性，同時存在Ccaat／

5、Enhancer Box、RXR、CAAT、CREB、Octamer、GATA、ERE、SREBPs、APl、鋅指蛋白等轉錄因子結合位點。此外，在第三個、第九個內含子中存在(CA)23、(TG)55、(TG)12重復的微衛(wèi)星序列，目前，這些微衛(wèi)星序列在Genbank中還沒有登錄，可能是新的微衛(wèi)星標記。根據(jù)牙鲆ALP全基因的結構特征以及mRNA的組織分布特點，認為克隆的牙鲆ALP屬于組織非特異性ALP。 利用生物信息學對克隆得到的

6、牙鲆ALP基因5'調控區(qū)進行分析，牙鲆ALP基因的轉錄起始位點(transcription start site，TSS)位于翻譯起始密碼子(ATG)上游65bp處，牙鲆ALP基因5'調控區(qū)沒有典型的TATA、CAAT、GC盒，推測轉錄起始位點上游-42～-35處TATTAAAA可能是TATA盒，在線軟件分析表明5'調控區(qū)內可能含有GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit1、RARE／TRE、AP

7、4等轉錄因子結合位點。同時軟件預測在牙鲆ALP基因5'調控區(qū)-105～-81處TTTTCAGTCACTGGTCATAAATTTG與共有序列AGGTCA很相似，所以推測CAGTCACTGGTCA可能是一個視黃酸／甲狀腺激素應答元件，且由兩個同向重復(Direct Repeat，DR)的半位點組成，兩個半位點間隔為1，記作DR1。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示牙鲆ALP基因5’調控區(qū)序列與斑馬魚的組織非特異性ALP啟動子具有同源性且更接近于哺乳動物的組織非

8、特異性ALP啟動子，啟動子區(qū)域的分子進化樹與cDNA進化樹以及物種進化樹基本一致。 為了進一步證實牙鲆ALP基因5'調控區(qū)和第一個內含子的啟動子活性，采用DNA重組的方法，將克隆得到的ALP基因5'調控區(qū)、第一個內含子序列插入到啟動子缺失的增強型綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-1、螢光素酶報告基因載體PGL3-Basic中，構建了重組表達載體。重組的EGFP載體通過脂質體的方法轉染COS-7細胞進行瞬時表達，在倒置熒光顯微鏡下可