魚腥藻FACHB709堿性磷酸酶基因無機(jī)磷饑餓應(yīng)答調(diào)控反應(yīng).pdf

1、藍(lán)藻(藍(lán)細(xì)菌)是一類古老的具有放氧光合作用的革蘭氏陰性細(xì)菌，在漫長的自然選擇過程中進(jìn)化出獨(dú)特的環(huán)境適應(yīng)能力，廣泛分布于不同的生境中。由于水體的富營養(yǎng)化，藍(lán)藻常常爆發(fā)形成水華，甚至釋放毒素，成為世界性的環(huán)境問題，引起公眾的關(guān)注。對(duì)磷極高的生物利用率是藍(lán)藻獲得生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)、導(dǎo)致藍(lán)藻水華發(fā)生的關(guān)鍵因素。雖然富營養(yǎng)化水體中磷源非常豐富，但藍(lán)藻等微生物能直接利用的無機(jī)磷卻很缺乏。因此，闡明藍(lán)藻細(xì)胞利用不同形式磷源的代謝調(diào)控，對(duì)揭示藍(lán)藻水華發(fā)生的分

2、子機(jī)制、監(jiān)測(cè)藍(lán)藻水華發(fā)生具有重要的意義。
　　 魚腥藻(Anabaena sp.)FACHB709是來源于淡水湖泊(中國，武漢東湖)的一種絲狀固氮藍(lán)藻。該藻與模式生物魚腥藻(Anabaena sp.)PCC7120高度同源，具有遺傳操作系統(tǒng)，可通過接合轉(zhuǎn)移將重組基因?qū)爰?xì)胞。本論文利用微生物學(xué)、生物信息學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，研究了不同磷源對(duì)魚腥藻FACHB709生長的影響、發(fā)現(xiàn)并鑒定了在藻細(xì)胞的磷代謝調(diào)控過程中具有關(guān)鍵作

3、用的堿性磷酸酶基因，并通過分析多個(gè)堿性磷酸酶基因?qū)Σ煌自吹谋磉_(dá)調(diào)控及其生理功能，以期揭示魚腥藻FACHB709堿性磷酸酶基因在磷代謝調(diào)控中的作用機(jī)制。
　　 本論文包括以下主要研究內(nèi)容和結(jié)果：
　　 (1)研究了不同種類、不同濃度磷源對(duì)魚腥藻FACHB709生長和堿性磷酸酶活性的影響，結(jié)果表明磷缺乏誘導(dǎo)藻細(xì)胞生長抑制而不是死亡；魚腥藻細(xì)胞通過上調(diào)堿性磷酸酶活性應(yīng)對(duì)磷饑餓。磷饑餓細(xì)胞在無機(jī)磷不存在的條件下，能利用有機(jī)磷G

4、-6-P和pNPP獲得部分生長。同時(shí)，有機(jī)磷的利用可在一定程度上導(dǎo)致細(xì)胞總堿性磷酸酶活性下降。
　　 (2)分析魚腥藻FACHB709和其它幾種藍(lán)藻的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)魚腥藻FACHB709是魚腥藻PCC7120和產(chǎn)水華藍(lán)藻-多變魚腥藻(Anabaena variabilis)ATCC29413的近源種。利用近緣種中公認(rèn)的堿性磷酸酶基因序列，擴(kuò)增并克隆了魚腥藻FACHB709中可能的堿性磷酸酶基因，對(duì)克隆的全基因DNA片段測(cè)序和分析

5、，發(fā)現(xiàn)魚腥藻FACHB709中存在四個(gè)堿性磷酸酶基因，分別為phoA-709、phoD1-709、phoD2-709和phoS-709。
　　 (3)構(gòu)建了魚腥藻FACHB709堿性磷酸酶基因啟動(dòng)子和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的轉(zhuǎn)錄融合重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移到魚腥藻FACHB709，通過測(cè)定所得魚腥藻調(diào)控報(bào)告菌株的β-半乳糖苷酶活性，分析四個(gè)堿性磷酸酶基因在不同濃度無機(jī)磷存在條件下的表達(dá)調(diào)控。結(jié)果表明，無機(jī)磷充足條件

6、下，除了phoD2-709沒有轉(zhuǎn)錄活性外，其余三個(gè)堿性磷酸酶編碼基因phoA-709、phoD1-709和phoS-709都有轉(zhuǎn)錄活性；無機(jī)磷缺乏條件下，四個(gè)堿性磷酸酶基因通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄水平，參與魚腥藻FACHB709的磷代謝調(diào)控反應(yīng)，其中以phoA-709的作用最為顯著。
　　 (4)利用免疫學(xué)方法，研究了魚腥藻FACHB709中四個(gè)堿性磷酸酶基因在蛋白水平的表達(dá)和分布。結(jié)果顯示無機(jī)磷缺乏條件下，四個(gè)堿性磷酸酶基因的表達(dá)水平全部

7、升高，且它們的表達(dá)產(chǎn)物分泌到了細(xì)胞外培養(yǎng)基中。
　　 (5)構(gòu)建堿性磷酸酶基因缺失突變株DRTH65(敲除phoA-709)和DRTH61(敲除phoS-709)，檢查突變株的生長和生理表型，結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)條件下，突變株DRTH65和DRTH61的生長和堿性磷酸酶活性與野生型魚腥藻的沒有差異。通過分析單個(gè)堿性磷酸酶基因缺失后，其余APase基因的表達(dá)調(diào)控，發(fā)現(xiàn)在含磷和缺磷條件下，phoD1-709和phoS-709轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)

8、一定程度上可彌補(bǔ)phoA-709的失活；而phoD1-709和phoA-709轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)則一定程度上彌補(bǔ)了phoS-709的失活。
　　 本論文得到以下主要結(jié)論：
　　 (1)無機(jī)磷是魚腥藻FACHB709細(xì)胞吸收和利用的主要磷源形式和關(guān)鍵生長因子；藻細(xì)胞通過調(diào)控堿性磷酸酶活性應(yīng)對(duì)無機(jī)磷饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制。
　　 (2)魚腥藻FACHB709是魚腥藻PCC7120的近緣種，并且具有與之相同的堿性磷酸酶基因

9、組成和序列高度同源的堿性磷酸酶PhoA-709、PhoD1-709、PhoD2-709和PhoS-709。
　　 (3)磷饑餓誘導(dǎo)魚腥藻FACHB709中四個(gè)堿性磷酸酶基因phoA-709、phoD1-709、phoD2-709和phoS-709轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的上調(diào)，但轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的程度存在差異。其中，phoA-709在藻細(xì)胞磷源代謝調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。
　　 (4)魚腥藻FACHB709中四個(gè)堿性磷酸酶PhoA-7