MNNG誘導(dǎo)人核糖核苷酸還原酶小亞基RRM2-p53R2基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制的研究.pdf

1、MNNG作為一種單功能烷化劑，被認(rèn)為是環(huán)境中廣泛存在的化學(xué)致癌物。其可以導(dǎo)致DNA斷裂、基因突變甚至腫瘤的發(fā)生。MNNG誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)可以激活許多修復(fù)相關(guān)基因。核糖核苷酸還原酶（RNR）催化核糖核苷二磷酸還原為脫氧核糖核苷二磷酸，在DNA合成和修復(fù)過(guò)程中起重要作用。人核糖核苷酸還原酶由兩個(gè)相同的大亞基（RRM1）和兩個(gè)相同的小亞基（RRM2或p53R2）組成兩種RR酶，即RRM1-RRM2和RRM1-p53R2。那么MNNG是否可

2、以影響細(xì)胞中RRM2或p53R2的表達(dá)水平，以及通過(guò)何種途徑影響至今沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。
　　本文研究了MNNG誘導(dǎo)RRM2和p53R2轉(zhuǎn)錄上調(diào)的作用和機(jī)制。(1)我們發(fā)現(xiàn)MNNG可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑誘導(dǎo)RRM2和p53R2基因表達(dá)上調(diào)，但不影響RRM1的表達(dá)水平。而且，MNNG不僅可以誘導(dǎo)RRM2/p53R2的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，同時(shí)也導(dǎo)致了它們的核轉(zhuǎn)位。(2)通過(guò)檢測(cè)MNNG處理前后p-H2AX水平，細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡比例，我們發(fā)現(xiàn)RRM

3、2主要參與MNNG誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)過(guò)程，而p53R2的作用相對(duì)較弱。(3)通過(guò)DNA pull-down偶聯(lián)LC-MS/MS篩選、以及ChIP-qPCR和免疫印跡法驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)MNNG處理KB細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄因子E2F3、E2F1及NFY結(jié)合到RRM2啟動(dòng)子。結(jié)合位點(diǎn)鄰近于E2F結(jié)合序列的NFY可以加強(qiáng)E2F3和E2F1結(jié)合到RRM2啟動(dòng)子上。通過(guò)使用免疫共沉淀技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)NFY與E2F3在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示相較

4、于E2F1，E2F3可以顯著激活RRM2的啟動(dòng)子報(bào)告基因活性。在KB細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)E2F3能夠增加RRM2的表達(dá)，從而降低MNNG誘導(dǎo)的p-H2AX水平。通過(guò)小RNA干擾E2F3可以有效抑制MNNG誘導(dǎo)的RRM2表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而增強(qiáng)p-H2AX水平。(4)有趣的是，MNNG主要通過(guò)翻譯后修飾導(dǎo)致E2F3水平上調(diào)。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)MNNG可以快速誘導(dǎo)NFYA和NFYB mRNA水平的上調(diào)。上調(diào)的NFY入核與E2F3聯(lián)合調(diào)控RRM2的轉(zhuǎn)錄。

5、(5)為了進(jìn)一步探究E2F3表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制，我們研究了E2F3上游可能的信號(hào)激酶。結(jié)果顯示MNNG是通過(guò)激活A(yù)TR-CHK1-E2F3信號(hào)通路上調(diào)E2F3蛋白水平，從而轉(zhuǎn)錄激活RRM2基因，參與DNA修復(fù)。對(duì)于p53R2，我們發(fā)現(xiàn)MNNG誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄上調(diào)不僅依賴(lài)于p53，同時(shí)也依賴(lài)于E2F1。而MNNG誘導(dǎo)的RRM2轉(zhuǎn)錄上調(diào)主要依賴(lài)于E2F3和NFY。
　　綜上所述，本文結(jié)果表明RNR參與化學(xué)致癌物MNNG誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)，