轉(zhuǎn)錄因子GATA-1-2對HCMV潛伏相關(guān)基因LUNA及UL126a轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過建立人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在人單核白血病細胞（THP-1細胞）潛伏及激活的細胞感染模型，應(yīng)用實時熒光定量PCR(real-time PCR)、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChromatinImmnuoprecipitation，ChIP)、免疫印跡(Western blot)和發(fā)夾狀RNA(shRNA)干擾等技術(shù)，分析HCMV潛伏及激活感染后轉(zhuǎn)錄因子GA TA-1與GATA

2、-2的表達及其與HCMV LUNA及UL126a基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系，明確GATA-1與GATA-2對HCMV LUNA及UL126a基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，為闡明HCMV潛伏及激活感染的分子機制提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.HCMV潛伏與激活感染模型的建立
　　利用HCMV AD169株感染THP-1細胞(1×106/ml，MOI=3)，37C、5％CO2的條件下培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h和96h收集細胞，提取總

3、DNA、總RNA與蛋白。Real-time PCR檢測細胞內(nèi)HCMV DNA拷貝數(shù);RT-PCR檢測HCMV IE1(UL123)和UL83 mRNA的表達。
　　采用佛波酯(PMA，100 ng/μl)刺激HCMV潛伏感染THP-1細胞分化為巨噬細胞，分別于24h、48h、72h和96h搜集細胞，提取總DNA、總RNA與蛋白。實時熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)HCMV DNA拷貝數(shù);RT-PCR檢測HCMV IE1(UL123)和UL

4、83 mRNA的表達。綜合判斷HCMV在THP-1細胞中的感染狀態(tài)。2.轉(zhuǎn)錄因子GATA-1與GATA-2對HCMV LUNA與UL126a基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
　　Western blot檢測HCMV潛伏及激活感染THP-1細胞24h、48h、72h和96h后轉(zhuǎn)錄因子GATA-1與GATA-2的表達;ChIP分析轉(zhuǎn)錄因子GATA-1與GATA-2與HCMV LUNA及UL126a基因5'上游啟動子區(qū)域的結(jié)合情況;RT-PCR檢測H

5、CMV LUNA及UL126a基因的表達。
　　3.shRNA干擾對HCMV LUNA及UL126a基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
　　利用具有靶向干擾作用的shRNA分別敲低THP-1細胞中轉(zhuǎn)錄因子GATA-1與GATA-2的表達后，分別檢測HCMV潛伏與激活感染THP-1細胞LUNA及UL126a基因的表達。
　　結(jié)果:
　　1.建立HCMV潛伏與激活感染細胞模型
　　HCMVAD169株感染THP-1細胞后，細胞內(nèi)H

6、CMV DNA載量基本不變;HCMV IE1 mRNA在感染后24h開始表達，其表達隨著感染時間增加而降低，UL83 mRNA未見表達。提示建立了HCMV潛伏感染的細胞模型。
　　PMA（終濃度為100 ng/μl）刺激HCMV潛伏感染的THP-1細胞分化后，細胞內(nèi)HCMV DNA載量隨著感染時間增加而升高;HCMV IE1 mRNA在感染后24h開始表達，其表達隨著感染時間增加而升高;UL83 mRNA在PMA刺激后第96h開始

7、表達。提示建立了HCMV激活感染的細胞模型。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子GATA-1與GATA-2參與HCMV LUNA與UL126a基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
　　HCMV潛伏及激活感染THP-1細胞96h后，Western blot檢測顯示，HCMV潛伏感染時GATA-1與GATA-2的表達量高于激活感染;ChIP分析結(jié)果顯示，HCMV潛伏感染時GATA-1及GATA-2與LUNA及UL126a基因5'啟動子區(qū)域的結(jié)合率均低于激活感染。<

8、br>　　3.shRNA干擾對HCMV LUNA及UL126a基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響
　　靶向GATA-1與GATA-2的shRNA轉(zhuǎn)染THP-1細胞96h后，Western blot檢測結(jié)果顯示，GATA-1與GATA-2的表達均明顯降低，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義;RT-PCR檢測結(jié)果顯示，HCMV LUNA與UL126a基因的表達均出現(xiàn)明顯的下降;且干擾后HCMV潛伏感染時LUNA與UL126a基因的表達明顯低于激活感染。
　　結(jié)