GATA轉(zhuǎn)錄因子對心肌能量代謝及細胞增殖的調(diào)控機制研究.pdf

1、目的:
　　 心臟具有生成ATP的巨大潛能以滿足對能量的高度需求。在胚胎時期及心肌肥大發(fā)生時,心臟主要依賴葡萄糖和乳糖作為底物產(chǎn)生ATP,而在出生后及成人心臟則主要依賴脂肪酸作為底物產(chǎn)生ATP而獲得能量。由于心肌的脂質(zhì)和葡萄糖儲存能力有限,因此,它們作為底物的選擇及ATP的生成是受到快速調(diào)節(jié)的,以迅速適應心臟的能量需求。
　　 這一調(diào)節(jié)過程涉及到多種基因不同時間的先后表達和相互作用,它們形成一個有序的網(wǎng)絡。該調(diào)節(jié)網(wǎng)絡包括

2、大量的,在時間和空間上極為精確的一系列分子事件。在這個過程中,哪怕是極微小的錯誤都將導致心肌能量代謝障礙的發(fā)生,而心肌能量代謝障礙,如線粒體脂肪酸氧化活性的降低,造成ATP產(chǎn)量減少,將會導致心泵功能、收縮功能及鈣離子的轉(zhuǎn)運功能等失調(diào),從而誘發(fā)心肌肥大和心力衰竭等。因此,深入研究心肌能量代謝關(guān)鍵基因的調(diào)控機制,將有助于從分子水平闡明心血管疾病的分子機理和病理學基礎,同時也可為心血管疾病的臨床防治和新藥設計提供更多線索。
　　 那么

3、,涉及心肌能量代謝的關(guān)鍵基因有什么呢?Glut4是調(diào)節(jié)心肌能量代謝的一個基因,它是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員,維持著機體葡萄糖的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。Glut4的表達具有組織特異性并受到激素調(diào)節(jié),Glut4基因敲除小鼠出現(xiàn)心肌肥大癥狀。因此,Glut4是調(diào)節(jié)心肌能量代謝的關(guān)鍵基因之一。鑒于此,Glut4作為心肌能量代謝的關(guān)鍵基因,其表達的降低或上調(diào),對于心肌能量代謝的調(diào)節(jié)具有重要的生理或病理意義,所以研究其調(diào)控機制,是心血管分子生物學領(lǐng)域的重要課題

4、。
　　 那么,參與心肌能量代謝的轉(zhuǎn)錄因子有哪些呢?過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome prolifcrator activated receptors,PPARs)是調(diào)節(jié)編碼脂肪酸β-氧化相關(guān)酶類基因的重要轉(zhuǎn)錄因子,它包含三種異形體:PPARα、PPARγ和PPARδ/β。這三種異形體都在心臟中表達,與PPARγ相比,PPARα和PPARδ/β在心肌細胞中的表達更為豐富。研究表明,心臟特異性過表達PPARα將誘導

5、與脂肪酸利用有關(guān)的基因表達,進而增強心臟脂肪酸的利用和氧化:PPARδ/β基因敲除小鼠嚴重地損害心肌脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達,增加心臟脂肪酸堆積,從而誘發(fā)脂毒性。因此,PPARs在調(diào)節(jié)心肌能量代謝中發(fā)揮著重要作用。
　　 GATA蛋白是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,因其識別序列(A/T)GATA(A/G)而得名。在該家族6個成員中,GATA4和GATA6是近年來心血管領(lǐng)域的研究熱點。大量的研究證明GATA4和GATA6是調(diào)控心臟發(fā)育以

6、及心肌細胞增殖、分化和凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子。但它們是否在心肌能量代謝中發(fā)揮調(diào)控作用,目前知之甚少。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是進化上高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA,通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)控靶基因的表達。近年來的研究表明miRNAs是心臟基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡的一個重要組成部分,但miRNAs是否作用于GATA蛋白與PPARs,進而對細胞的表型產(chǎn)生影響,目前還鮮有報道。
　　 因此,本課題以GATA轉(zhuǎn)錄因子為中心,采

7、用多種方法深入研究了GATA6、PPARα、miR-200b以及GATA4對心肌能量代謝和細胞增殖的調(diào)控機制。
　　 研究方法與結(jié)果:
　　 第一部分:轉(zhuǎn)錄因子GATA6招募PPARα協(xié)同激活Glut4基因的表達
　　 為進一步了解GATA家族對心肌能量代謝的調(diào)控作用,采用了瞬時轉(zhuǎn)染、Q-PCR、熒光素酶報告基因、Western Blot、CoIP、GST pull-down和ChIP等實驗方法,證實了在PPAR

8、α激動劑fenofibrate刺激的心肌細胞中,轉(zhuǎn)錄因子GATA6能夠招募核受體PPARα至葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut4啟動子的GATA元件上,這種招募能夠進一步激活Glut4基因的表達,并且伴隨著線粒體功能的促進及葡萄糖利用的增加。
　　 Western Blot及Q-PCR實驗顯示GATA6或PPARα及其激動劑fcnofibrate都能夠刺激Glut4基因的表達,若二者共表達則可以產(chǎn)生更強烈的激活效應,說明GATA6和PPAR

9、α協(xié)同激活Glut4基因轉(zhuǎn)錄。CoIP實驗證實GATA6和PPARα相互作用。GST pull-down實驗顯示GATA6的C端鋅指和PPARα的N端鋅指介導二者間的相互作用。ChIP及熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步證實GATA6通過與PPARa蛋白的N端 TAD和鋅指結(jié)構(gòu)域相互作用,招募PPARα至Glut4啟動子從而協(xié)同激活Glut4基因的表達,促進線粒體的功能及葡萄糖的利用。
　　 該部分的研究證實了轉(zhuǎn)錄因子GATA6是心肌能

10、量代謝的重要調(diào)節(jié)因子,核受體PPARα是GATA6調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過程中新的相互作用因子,這為理解GATA6在心臟發(fā)育和心臟疾病的作用機制提供了新的分子基礎。
　　 第二部分:fenofibrate和Dox對小鼠NADH氧化酶及檸檬酸脫氫酶活性的影響
　　 多柔比星(doxorubicin,Dox)是一種常用的抗腫瘤藥物,由于它的嚴重毒性大大限制了它的臨床使用。線粒體功能障礙是其潛在的致毒機制之一,但具體機制未知。由于在第一

11、部分研究中觀察到PPARα對細胞線粒體功能具有保護作用,所以我們進一步研究了PPARα激動劑fenofibrate在體內(nèi)能否保護線粒體功能并逆轉(zhuǎn)Dox的毒性。
　　 將8周大的小鼠隨機分為四組并給予不同的處理:對照組:每天0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃一次,連續(xù)14天;fenofibrate處理組:每天fenofibrate(100mg/kg)灌胃一次,連續(xù)14天;Dox處理組:第12、13和14天,每天腹腔注射Dox(15mg/k

12、g)一次;聯(lián)合組:同時接受fenofibrate和Dox處理。14天后處死小鼠,分離提取心室、心房、肝臟、腎臟、肺和脾臟組織的線粒體,檢測線粒體功能的標志酶檸檬酸合酶及NADH氧化酶活性。結(jié)果顯示:fenofibrate可在多個組織中保護線粒體功能,相反,Dox則在多數(shù)組織中抑制線粒體的功能,而且,fenofibrate在心室和腎臟中能夠逆轉(zhuǎn)Dox的毒性。
　　 這一研究證實fenofibrate對線粒體檸檬酸合酶和NADH氧化

13、酶具有保護作用,并且在心室和腎臟中能夠逆轉(zhuǎn)Dox的毒性作用,為臨床上如何減輕Dox的化療副作用提供了理論依據(jù)。
　　 第三部分:miR-200b作用于GATA4對細胞增殖、周期和凋亡的調(diào)控
　　 為了尋找GATA家族的上游調(diào)控分子,經(jīng)生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)GATA4可能是miR-200b的靶基因。miR-200b參與調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程,是腫瘤細胞形成的重要調(diào)控因子。由于miRNAs調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等多個

14、生理學和病理學過程,因此,我們采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、RNAi、熒光素酶報告基因、MTT、流式細胞術(shù)、DAPI染色RT-qPCR等實驗方法研究了miR-200b對細胞增殖、周期和凋亡的影響。
　　 結(jié)果顯示:過表達GATA4和miR-200b分別促進和抑制C2C12及P19細胞的增殖。而且,過表達miR-200b及siRNA抑制GATA4表達均誘導細胞發(fā)生G0/G1期阻滯,S期和G2/M期細胞百分比降低。DAPI染色證實miR-200b過

15、表達還能誘導細胞核發(fā)生凋亡。熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鱩iR-200b可與GATA43’非翻譯區(qū)(3'-UTR)特異性結(jié)合。Western Blot實驗進一步驗證了miR-200b可以在蛋白水平上抑制GATA4的表達,表明GATA4確系miR-200b的靶基因。
　　 該研究證實了GATA4是miR-200b的靶基因,miR-200b通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)控GATA4的蛋白表達,進而抑制細胞的增殖,致使細胞發(fā)生G0/G1期阻滯,并誘導細

16、胞發(fā)生凋亡。這些結(jié)果表明miR-200b可能通過靶向GATA4在心臟發(fā)育、增殖與凋亡等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、在PPARα激動劑fenofibrate刺激的心肌細胞中,轉(zhuǎn)錄因子GATA6招募核受體PPARα至葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut4啟動子的GATA元件上,這種招募能夠進一步激活Glut4的表達,并且伴隨著線粒體功能的促進及葡萄糖利用的增加。
　　 2、PPARα激動劑fenofibrat

17、e對線粒體檸檬酸合酶和NADH氧化酶具有保護作用,可減輕抗癌藥物Dox誘導的心、腎毒性。3、miR-200b作用于轉(zhuǎn)錄因子GATA4,抑制C2C12細胞和P19細胞的增殖,致使細胞發(fā)生G1/G0期阻滯并誘導細胞凋亡。
　　 本研究證實了GATA6是心肌能量代謝調(diào)控網(wǎng)絡中的重要組成成分,并且作為PPARα的輔助激活因子協(xié)同PPARα調(diào)控心肌能量代謝。這為理解GATA6在心臟發(fā)育和心臟疾病的作用機制提供了新的分子基礎。這一研究還揭示