人巨細(xì)胞病毒RL13基因轉(zhuǎn)錄和mRNA結(jié)構(gòu)以及UL141基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、目的：
　　 人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是導(dǎo)致新生兒先天畸形和出生缺陷的首要感染因素，其危害巨大，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。關(guān)于HCMV先天感染致病機(jī)理的研究已經(jīng)成為兒科學(xué)和人類病毒學(xué)領(lǐng)域中一項(xiàng)重要課題。HCMV在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)有一定時(shí)序性，不同時(shí)期的表達(dá)產(chǎn)物可能在病毒復(fù)制周期中執(zhí)行不同功能。認(rèn)識(shí)基因的轉(zhuǎn)錄方式及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)于全面認(rèn)識(shí)HCMV基因生物學(xué)功能，進(jìn)而揭示HCMV致病機(jī)理具

2、有重要意義。RL13基因是HCMV基因組中的一員，在成纖維細(xì)胞中能夠抑制病毒復(fù)制，目前RL13基因在臨床株中轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)尚未明確，本文采用cDNA文庫(kù)篩選，Northern blot及cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）等實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)RL13基因在一株臨床株中的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行研究。UL141基因位于HCMV UL/b'區(qū)，是HCMV基因組中一個(gè)重要的免疫調(diào)節(jié)基因。我們?cè)谇捌谘芯恐?/p>

3、發(fā)現(xiàn)，在不同分離株中存在多種起始位置不同的UL141基因轉(zhuǎn)錄本。這種轉(zhuǎn)錄起始位置的差異提示UL141基因不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)調(diào)控存在差異。本研究采用熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，競(jìng)爭(zhēng)性EMSA及酵母單雜交篩選對(duì)UL141基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行了研究。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 所用病毒株為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室保存的HCMV臨床低傳代分離株H和CH;人胚肺成纖維細(xì)胞（human emb

4、ryonic lung fibroblast，HELF）MRC-5購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);HCMV H株晚期cDNA文庫(kù)及HCMV-人胚肺細(xì)胞cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室構(gòu)建和保存;DIGNorthern Starter Kit購(gòu)自Roche公司，3'-Full RACE Core Set Ver.2.0及5'-Full Race Kit購(gòu)自TakaRa公司，pGL3熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒、Dual-Luci

5、ferase? ReporterAssay System、DNA Purification System及Plasmid DNA Purification System購(gòu)自Promega公司;引物合成及測(cè)序由Invitrogen公司完成;常用實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括Beckman臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、Bio-rad PCR循環(huán)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱等;所用數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件包括基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、引物設(shè)計(jì)軟件、序列分析軟件等。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　

6、 （一）cDNA文庫(kù)篩選
　　 設(shè)計(jì)RL13基因特異性引物，運(yùn)用PCR技術(shù)依次從cDNA文庫(kù)三級(jí)、二級(jí)、一級(jí)模板和單克隆中篩選出含有RL13基因序列的陽(yáng)性克隆。
　　 （二）Northern blot
　　 合成RL13基因特異性RNA探針，應(yīng)用NortheRN blot技術(shù)檢測(cè)RL13基因在病毒感染不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄時(shí)序和轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度。
　　 （三）3'RACE和5'RACE
　　 通過(guò)3'RAC

7、E及5'RACE獲得RL13基因轉(zhuǎn)錄本確切的5'端及3'端序列。
　　 （四）熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
　　 1、構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體-轉(zhuǎn)錄本非編碼序列質(zhì)粒，研究UL141基因上游非編碼序列是否具有啟動(dòng)子活性。
　　 2、采用5'缺失突變技術(shù)，鑒定具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力的片段，并確定調(diào)控元件核心序列。
　　 3、構(gòu)建調(diào)控元件-異源啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，觀察調(diào)控序列對(duì)異源啟動(dòng)子的作用，進(jìn)一步確定調(diào)

8、控元件的調(diào)控能力。
　　 （五）電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)
　　 1、人工合成生物素標(biāo)記和非標(biāo)記的調(diào)控序列，同時(shí)提取MRC-5細(xì)胞核蛋白
　　 2、按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置體系，孵育20min，同時(shí)將非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行預(yù)電泳100V，1h。
　　 3、上樣后電泳100V，45min。
　　 4、電壓100V，轉(zhuǎn)膜45min

9、。
　　 5、紫外交聯(lián)10min，逐步洗膜后進(jìn)行ECL發(fā)光，分析結(jié)果。
　　 （六）酵母單雜交篩選
　　 應(yīng)用人工合成結(jié)合同尾酶法構(gòu)建酵母單雜交系統(tǒng)報(bào)道子，轉(zhuǎn)化Y187酵母細(xì)胞。擴(kuò)增HCMV-人胚肺細(xì)胞cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)并提取質(zhì)粒，將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有報(bào)道子的酵母細(xì)胞，將含有兩種質(zhì)粒的酵母細(xì)胞在適當(dāng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從平板上長(zhǎng)出的克隆中提取酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定并測(cè)序，根據(jù)獲得的cDNA序列確定與報(bào)道子結(jié)合的

10、蛋白。
　　 結(jié)果：
　　 一、cDNA文庫(kù)篩選
　　 從cDNA文庫(kù)中共篩選出20個(gè)含有RL13特異序列的陽(yáng)性cDNA克隆，共包含7種不同長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度分別為3628，3114，2515，2443，1737，1240和1029個(gè)核苷酸(nucleotide，nt)。這7種轉(zhuǎn)錄本具有相同的3'末端，不同的5'末端。
　　 二、Northern blot檢測(cè)
　　 在H株的感染晚期(late，L

11、) RNA中共檢測(cè)到8種RL13基因轉(zhuǎn)錄本。其中2種轉(zhuǎn)錄本（3114nt及2515-2443nt）在病毒感染的早期(early,E)開(kāi)始出現(xiàn)，晚期(late，L)達(dá)到高峰。
　　 三、5'RACE及3'RACE
　　 RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RL13基因轉(zhuǎn)錄本具有相同的3'末端和不同的5'末端。同HCMV Towne株(No.FJ61628)比較，3'末端位于第11717位核苷酸，5'末端分別位于第8132，8643，92

12、98，10493，10704和10886位核苷酸，結(jié)合3'RACE及5'RACE結(jié)果，RACE實(shí)驗(yàn)共鑒定出6種轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度分別為3628，3114，2459，1240，1029和846個(gè)核苷酸。
　　 四、RL13 ORF基因進(jìn)化分析
　　 進(jìn)行比對(duì)的7株（H，CH，Towne，TB40/E，Toledo，Merlin及AD169）分為3組，RL13開(kāi)放閱讀碼框架（Open reading frame，ORF）的一致性在

13、15.7-99.3％之間，其中H株與Towne株的一致性為90.3％。
　　 五、熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
　　 1、UL141基因上游1499bp非編碼序列具有啟動(dòng)子活性。
　　 2、確定了一個(gè)33bp的正調(diào)控元件及一個(gè)33bp負(fù)調(diào)控元件。
　　 3、證實(shí)了調(diào)控元件對(duì)異源啟動(dòng)子具有調(diào)控作用。
　　 六、競(jìng)爭(zhēng)性EMSA實(shí)驗(yàn)
　　 EMSA結(jié)果表明，人胚肺細(xì)胞核蛋白中含有正、負(fù)調(diào)控序列的

14、結(jié)合蛋白，此種結(jié)合可以被同源序列競(jìng)爭(zhēng)，說(shuō)明結(jié)合蛋白與調(diào)控序列的結(jié)合為特異性結(jié)合。
　　 七、酵母單雜交
　　 應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)從HCMV-人胚肺細(xì)胞cDNA酵母文庫(kù)中篩選出一些分別可與正、負(fù)調(diào)控元件相結(jié)合的候選轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選，Northern blot，RACE等實(shí)驗(yàn)證實(shí)HCMV RL13基因在E期開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，L期轉(zhuǎn)錄達(dá)到高峰，推測(cè)其是L期基因。HCMV RL13

15、基因至少有7種轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)，這些轉(zhuǎn)錄本均為非拼接結(jié)構(gòu)，具有相同的3'末端，不同的5'末端，長(zhǎng)度分別為3628、3114、2515-2443、1737、1240、1029和846nt。
　　 通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)確定了UL141基因上游非編碼區(qū)1499bp片段具有啟動(dòng)子活性，并且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)正調(diào)控元件及一個(gè)負(fù)調(diào)控元件;通過(guò)EMSA證實(shí)了正、負(fù)調(diào)控序列可與MRC-5細(xì)胞核蛋白相結(jié)合，從而調(diào)控UL141基因的轉(zhuǎn)錄;通過(guò)酵母單雜交技