脂聯(lián)素對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移和成管的影響.pdf

1、目的：脂聯(lián)素（adiponectin，APN）對缺血性心腦血管疾病具有保護作用。脂聯(lián)素通過保護內(nèi)皮細(xì)胞功能、促進(jìn)血管新生、減輕炎癥反應(yīng)等促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPC）具有干細(xì)胞增殖分化的能力，可以參與內(nèi)皮細(xì)胞成管，促進(jìn)血管新生和缺血后的血管新生。目前尚未有利用內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合脂聯(lián)素轉(zhuǎn)基因治療腦缺血的研究，我們設(shè)想將脂聯(lián)素與內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合治療，觀察對腦缺血神經(jīng)功能恢復(fù)

2、的影響。本實驗旨在研究脂聯(lián)素對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移、成管等血管新生相關(guān)功能的影響。
　　方法：⑴采用臍帶血分離單核細(xì)胞方式分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，并鑒定。⑵構(gòu)建攜帶脂聯(lián)素基因的慢病毒（lentivirus-GFP-APN）以及攜帶綠色熒光的對照病毒（lentivirus-GFP），使用慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，構(gòu)建APN-EPC和GFP-EPC穩(wěn)轉(zhuǎn)株，并鑒定轉(zhuǎn)染后脂聯(lián)素的表達(dá)。⑶采用CCK8試劑盒檢測并比較APN-EPC和GFP-EPC的

3、增殖能力，采用劃痕實驗和transwell檢測并比較APN-EPC和GFP-EPC的遷移能力，檢測APN-EPC和GFP-EPC體外成管能力。
　　結(jié)果：①采用單核細(xì)胞分離方式從臍帶血中分離的內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)鑒定符合國際上對內(nèi)皮祖細(xì)胞的定義，培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞具有增殖、分化等干細(xì)胞的功能，同時具有內(nèi)皮細(xì)胞體外成管功能。②攜帶脂聯(lián)素基因的慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞后可以穩(wěn)定表達(dá)脂聯(lián)素和綠色熒光蛋白，并且可以隨著增殖傳代穩(wěn)定低傳給后代。③A：CC

4、K8檢測脂聯(lián)素增殖：GFP-EPC組OD值小于APN-EPC組（GFP-EPC組OD值＝0.56±0.04，APN-EPC組OD值＝0.81±0.36，N＝5，P＝0.001）；B：劃痕實驗顯示：GFP-EPC組5h細(xì)胞遷移面積小于APN-EPC組（GFP-EPC組遷移率：15.58％±4%，APN-EPC組遷移率：23.71%±1%，N＝5，P＝0.002）；C：transwell實驗：平均每個高倍鏡視野（10X）遷移細(xì)胞GFP-EP

5、C組小于APN-EPC組（GFP-EPC組每高倍鏡視野遷移細(xì)胞數(shù)：19.33±2.24，APN-EPC組每高倍鏡視野遷移細(xì)胞數(shù)：43.07±1.224，N＝3，P＝0.001）；D：成管實驗：5h：APN-EPC組成管長度是GFP-EPC組的1.36倍，P＝0.001，24h APN-EPC組成管長度是GFP-EPC組的1.34倍,P＝0.01。
　　結(jié)論：⑴成功實現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)和傳代。⑵脂聯(lián)素可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移