角蛋白24在表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞中的作用研究.pdf

1、角蛋白是一類典型的上皮細胞中間絲蛋白，具有分子多樣性的特點。在人類，存在54種功能角蛋白基因。在不同的上皮類型或者不同的細胞分化狀態(tài)中，角蛋白的表達形式存在特異性。作為上皮細胞骨架的組成部分，角蛋白在維持上皮細胞機械穩(wěn)定性和組織完整性中參與重要作用。除了結(jié)構(gòu)性功能外，近年來，一些角蛋白還被發(fā)現(xiàn)具有新的調(diào)節(jié)功能，如參與細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷應(yīng)答和組織重塑。
　　角質(zhì)形成細胞是皮膚表皮的主要構(gòu)成細胞，皮膚通過調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞增殖和分

2、化來維持其屏障功能。在角質(zhì)形成細胞分化之初，角質(zhì)形成細胞主要表達早期分化標(biāo)記物，如:角蛋白1和角蛋白10。隨著分化的不斷進展，角質(zhì)形成細胞開始表達不同的分化相關(guān)蛋白，如:fillaggrin，involucrin，loricrin，角蛋白2等。
　　既往研究發(fā)現(xiàn)，角蛋白異常與包括增殖性皮膚病和遺傳性皮膚病在內(nèi)的多種皮膚疾病相關(guān)。在銀屑病中，角質(zhì)形成細胞的增殖與分化存在異常，角質(zhì)形成細胞表現(xiàn)為高增殖和異常分化的狀態(tài)，而這些是銀屑病皮

3、損形成的主要原因。
　　皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一種復(fù)雜的生理過程，由多種類型的細胞和信號通路的參與。其中，真皮成纖維細胞已被廣泛用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)機制的研究中。既往研究已經(jīng)闡明，真皮成纖維細胞的遷移、增殖以及其分泌細胞外基質(zhì)的功能在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用?；诔衫w維細胞的細胞療法可以作為皮膚過度炎癥和組織修復(fù)延遲的一種治療方法。與此同時，既往研究亦表明，角蛋白在對皮膚創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。角蛋白敷料可防止傷口干燥，促進皮

4、膚屏障建立，從而促進傷口愈合。
　　角蛋白24(Keratin24，K24)是一種新型角蛋白，它是一種包含有525個氨基酸的角蛋白樣蛋白，屬于Ⅰ型角蛋白聚合物。K24在角質(zhì)形成細胞、胎盤、結(jié)腸、脾臟中表達較豐富。在人類，有研究發(fā)現(xiàn)，K24可能是早期大腸癌的發(fā)病的易感基因。亦有研究表明，K24參與角膜上皮細胞的終末分化。然而其在皮膚細胞中的生物學(xué)功能尚未闡明。
　　目的：
　　本研究目的在于，一方面通過研究K24在表皮角

5、質(zhì)形成細胞中的表達及生物學(xué)作用，為探索K24與銀屑病之間的關(guān)聯(lián)奠定基礎(chǔ);另一方面，通過研究K24在真皮成纖維細胞中的作用及功能，以期發(fā)現(xiàn)其在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的潛在應(yīng)用價值。
　　方法：
　　第一部分:分離培養(yǎng)正常人及銀屑病患者皮損區(qū)表皮角質(zhì)形成細胞，提取細胞總RNA和蛋白質(zhì)。通過qRT-PCR和Western blot法檢測正常人以及銀屑病患者皮損區(qū)表皮角質(zhì)形成細胞中K24的mRNA及蛋白表達水平;利用細胞和組織免疫熒光法檢測

6、正常角質(zhì)形成細胞和人體皮膚組織中K24的表達和定位;通過體外傳代和CaCl2誘導(dǎo)分化兩種方法，觀察不同分化狀態(tài)的角質(zhì)形成細胞中K24的表達差異。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立過表達K24的角質(zhì)形成細胞模型。通過qRT-PCR和Western blot法驗證慢病毒轉(zhuǎn)染后K24在角質(zhì)形成細胞中過表達的效率。利用Western blot法分析K24過表達后其下游蛋白分子，如細胞分化、細胞周期、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、PKC信號通路相關(guān)蛋白表達水平;通過細胞

7、功能學(xué)實驗方法觀察K24過表達對角質(zhì)形成細胞增殖、細胞周期、分化、衰老、凋亡以及遷移的影響。構(gòu)建Krt24-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，獲得穩(wěn)定陽性子代后，分離培養(yǎng)其表皮角質(zhì)形成細胞，通過qRT-PCR法，與野生型小鼠表皮角質(zhì)形成細胞對比分析，驗證前述實驗結(jié)果。
　　第二部分:利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建過表達K24的真皮成纖維細胞模型，并通過qRT-PCR和Western blot法確認慢病毒的感染效率。繼而主要通過qRT-PCR、Weste

8、rn blot法及細胞功能學(xué)實驗方法研究K24過表達后對真皮成纖維細胞增殖、遷移、衰老的影響。分離培養(yǎng)Krt24-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠真皮成纖維細胞，通過細胞功能學(xué)檢測以及qRT-PCR法，與野生型小鼠真皮成纖維細胞進行對比分析，驗證前述實驗結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　一、K24在表皮角質(zhì)形成細胞中的表達及作用
　　1.Western blot結(jié)果提示，體外培養(yǎng)的銀屑病皮損區(qū)來源的角質(zhì)形成細胞中K24的蛋白表達水平低于正常角質(zhì)

9、形成細胞。
　　2.細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，K24在正常人角質(zhì)形成細胞中呈胞漿分布;組織免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，在正常人表皮中，K24主要表達于棘細胞上層，在基底層及棘層少量表達。
　　3.通過體外傳代和Ca2+誘導(dǎo)兩種方法誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細胞分化發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，K24在衰老及分化較為明顯的角質(zhì)形成細胞中蛋白表達更豐富。
　　4.MTS及EdU檢測提示，與對照組相比，正常人角質(zhì)形成細胞過表達K24后，增殖能力及細胞活性降低;

10、流式細胞周期結(jié)果顯示，K24過表達的人角質(zhì)形成細胞出現(xiàn)了細胞周期的G1/S期阻滯;Western blot結(jié)果進一步提示，增殖相關(guān)蛋白K14、K17、c-Myc表達下調(diào);細胞周期相關(guān)蛋白p53，p21表達上調(diào)。
　　5.透射電鏡法及流式凋亡檢測提示，K24過表達誘導(dǎo)自噬并促進人表皮角質(zhì)形成細胞凋亡的發(fā)生;Western blot結(jié)果提示，自噬相關(guān)蛋白Atg5和Atg7，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3表達上調(diào)。

11、>　　6.Western blot結(jié)果提示，K24過表達促進人表皮角質(zhì)形成細胞的分化，角質(zhì)形成細胞分化相關(guān)蛋白K1，loricrin和involucrin的表達上調(diào)。
　　7.細胞免疫熒光結(jié)果提示，K24過表達誘導(dǎo)人表皮角質(zhì)形成細胞的細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞骨架蛋白α-tubulin表達上調(diào);β半乳糖苷酶檢測提示，K24過表達亦促進角質(zhì)形成細胞衰老的發(fā)生。
　　8.Transwell試驗結(jié)果提示，K24過表達抑制人表皮角質(zhì)形成

12、細胞的遷移能力;Western blot結(jié)果提示，K24過表達促進角質(zhì)形成細胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達上調(diào)，N-cadherin和Slug表達下調(diào)。
　　9.Western blot結(jié)果提示，人表皮角質(zhì)形成細胞過表達K24后，與對照組相比，PKCδ蛋白磷酸化水平增加。
　　10.qRT-PCR結(jié)果提示，與野生型小鼠來源的表皮角質(zhì)形成細胞相比，Krt24過表達小鼠來源的表皮角質(zhì)形成細胞在過表達Krt24mRNA的

13、基礎(chǔ)上，低表達Krt14，高表達loricrin及involucrin，高表達p21及p53，提示Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠表皮角質(zhì)形成細胞增殖能力減弱，呈趨于分化及衰老的狀態(tài)。
　　二、K24對真皮成纖維細胞的作用及功能影響
　　1.K24過表達通過促進人真皮成纖維細胞的細胞周期由G1期向S+G2/M期過渡，從而增強了成纖維細胞的增殖及克隆形成能力。
　　2.K24過表達促進人真皮成纖維細胞的遷移能力，上調(diào)間質(zhì)表型標(biāo)記蛋白

14、:α-SMA、FN、β-catenin、MMP3及細胞外基質(zhì)產(chǎn)物Collagen1a在蛋白水平的表達。
　　3.K24過表達抑制人真皮成纖維細胞的衰老，同時抑制了細胞周期及衰老相關(guān)蛋白p53、HMGN2、HMGB2在mRNA及蛋白水平的表達。
　　4.MTS檢測提示，Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠來源的真皮成纖維細胞較野生型小鼠來源的真皮成纖維細胞增殖能力增強。
　　5.Transwell結(jié)果提示，Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠來源的真皮

15、成纖維細胞較野生型小鼠來源的真皮成纖維細胞遷移能力增強;qRT-PCR結(jié)果提示，在mRNA水平，與野生型小鼠成纖維細胞相比，Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細胞中E-cadherin表達下調(diào)，而FN、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、PAI-1和MMP3表達上調(diào)，進一步提示Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠來源的真皮成纖維細胞遷移能力增強。
　　6.qRT-PCR結(jié)果提示，在mRNA水平，與野生型小鼠真皮成纖維細胞相比，Krt24轉(zhuǎn)

16、基因小鼠真皮成纖維細胞中Collagen1a和Collaggen3a表達上調(diào)，提示Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠真皮成纖維細胞膠原合成能力增強。
　　結(jié)論：
　　K24在正常角質(zhì)形成細胞中蛋白水平高于銀屑病角質(zhì)形成細胞。在正常人表皮角質(zhì)形成細胞中，K24主要呈胞漿分布;在正常人表皮中，K24主要表達于棘細胞上層。K24過表達于表皮角質(zhì)形成細胞后，抑制角質(zhì)形成細胞增殖、遷移，促進細胞分化、衰老、自噬及凋亡的發(fā)生。
　　K24過表達