整合素和細胞外基質(zhì)在硬皮病與銀屑病皮損角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞中的比較研究.pdf

1、研究背景
　　 在過去的20年中，皮膚中整合素和ECM的表達成為了研究熱點。整合素家族和ECM蛋白在皮膚的不同區(qū)域和發(fā)育不同時期的表達變化造成了不同的粘附環(huán)境，使皮膚能夠更好地利用不同的細胞。這對于維持表皮結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定是十分有力的。硬皮病和銀屑病作為皮膚科的兩大常見疾病，與整合素以及ECM的關(guān)系也早有研究。然而，有研究者指出銀屑病病變發(fā)生在皮膚全層，而不是僅有表皮的異常。那么是否硬皮病的表皮也牽涉于發(fā)病機制之中呢?
　

2、　 銀屑病是以表皮過度增殖、血管內(nèi)皮異常增生和淋巴細胞浸潤為特征的慢性炎癥性皮膚病。而纖維化，血管損傷甚至栓塞是硬皮病患者后期的主要病理特征。根據(jù)銀屑病和硬皮病的兩極化病理表現(xiàn)，我們大膽假設(shè)，在銀屑病和硬皮病患者的角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞中可能存在截然相反的分子改變，需要進一步大量的實驗數(shù)據(jù)支持這一假說。因此，我們進行了相關(guān)的研究。
　　 目的
　　 明確整合素α5和β4在正常人表皮，硬皮病和銀屑病皮損區(qū)角質(zhì)形成細

3、胞中的表達情況，重點研究不同生理、病理狀態(tài)下的角質(zhì)形成細胞中不同細胞因子對整合素α5和β4的調(diào)節(jié)作用；某些調(diào)控因素如Ca++及地塞米松對正常皮膚，硬皮病/銀屑病皮損成纖維細胞ECM蛋白，包括FN，CTGF，col-1A的表達的影響，及可能涉及的細胞通路。
　　 方法
　　 第一部分：活檢皮膚一分為二，一部分包埋制成蠟塊。另一部分分離、培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞，提取總蛋白質(zhì)。以免疫組化法檢測整合素α5和β4在正常皮膚，硬皮病/銀屑

4、病皮損的表達情況。以WB法檢測正常/硬皮病/銀屑病表皮角質(zhì)形成細胞中整合素α5和β4蛋白質(zhì)的表達水平；使用外源性IL-1β，IL-13，IL-17A，TNF-α，TGF-β1，ET-1，IFN-γ，VEGF165作為刺激因子，觀察它們對不同生理、病理狀態(tài)下的表皮角質(zhì)形成細胞整合素α5和β4蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)。
　　 第二部分：分離、培養(yǎng)正常真皮及硬皮病、銀屑病皮損區(qū)成纖維細胞，提取總蛋白質(zhì)。以WB法檢測Ca++和地塞米松對成纖維細胞E

5、CM蛋白質(zhì)(FN，CTGF，col-1A)表達的影響；以ERK/Rho/p53抑制劑阻斷相應細胞通路，了解影響成纖維細胞ECM蛋白質(zhì)表達的可能機制。
　　 結(jié)果
　　 1、整合素α5和β在正常皮膚，硬皮病/銀屑病皮損中的定位和表達
　　 1)整合素α5和β4在硬皮病中的表達：α5在正常人和硬皮病患者表皮基底層和鄰近基底層的棘細胞層表達較強，顆粒層和鄰近顆粒層的棘細胞層表達較少，角質(zhì)層沒有表達；而β4表達于正常人和

6、硬皮病患者表皮各層，但是在基底層表達極弱。然而β4在正常人表皮細胞的胞膜和胞漿均有表達，在硬皮病患者表皮僅在胞膜表達。α5在硬皮病患者的角質(zhì)形成細胞表達下降，但是無顯著性差異；而β4在硬皮病患者的角質(zhì)形成細胞表達下降，且有顯著性差異。
　　 2)整合素α5和β4在銀屑病中的表達：α5在正常人表皮除角質(zhì)層外的各層具有表達，基底層和鄰近基底層的棘細胞層表達較強；而在銀屑病表皮的基底層和棘細胞層均勻表達，為強陽性。β4表達于正常人表皮

7、各層，但是在基底層表達極弱；然而在銀屑病患者表皮的角質(zhì)層和基底層無表達。α5和β4在正常人和銀屑病患者的表皮角質(zhì)形成細胞中的蛋白表達量亦有所差異：α5在銀屑病患者的角質(zhì)形成細胞表達增加，且有顯著性差異；而β4在銀屑病患者的角質(zhì)形成細胞表達下降，但是無顯著性差異。
　　 3)IL-17A、ET-1、TNF-α、IFN-γ對正常人和硬皮病患者表皮角質(zhì)形成細胞中整合素α5和β4的調(diào)節(jié)作用：正常人表皮角質(zhì)形成細胞中，IL-17A作用下，

8、α5蛋白質(zhì)表達略有增加；ET-1作用下，α5表達變化不明顯；而TNF-α或IFN-γ處理后，α5蛋白質(zhì)表達增加。而在硬皮病表皮角質(zhì)形成細胞中，IL-17A作用使α5蛋白質(zhì)表達增加；ET-1，TNF-α或IFN-γ作用后，α5蛋白質(zhì)表達顯著增加。正常人表皮角質(zhì)形成細胞中，IL-17A、ET-1、TNF-α或IFN-γ作用后，β4蛋白質(zhì)表達均增加。而在硬皮病表皮角質(zhì)形成細胞中，IL-17A、ET-1、TNF-α或IFN-γ作用后，β4蛋白質(zhì)

9、表達基本無變化。
　　 4)IL-13、IL-7A、ET-1、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、TGF-β1、VEGF165對正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細胞中整合素α5和β4的調(diào)節(jié)作用：正常人表皮角質(zhì)形成細胞中，IL-13、ET-1、IL-17A、TNF-α或IFN-γ作用后，α5蛋白質(zhì)表達增加，TGF-β1，VEGF165對α5無影響，而IL-1β使α5表達下降。而IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α、IFN-

10、γ)、IL-1β、TGF-β1或VEGF165處理后，β4蛋白質(zhì)表達均增加，尤其是IL-13、IFN-γ、IL-β、TGF-β1和VEGF165。然而，在銀屑病表皮角質(zhì)形成細胞中，IL-13、ET-1、TNF-α，IFN-γ、VEGF165處理，能使α5表達減少；IL-17A能使其明顯減少；IL-1β或TGF-β1對α5無影響。IL-17A或TNF-α作用24h后，β4蛋白質(zhì)表達減少；而IL-13、ET-1、IFN-γ、IL-1β、TG

11、F-β1和VEGF165作用后，β4蛋白質(zhì)表達無影響。
　　 5)IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α，IFN-γ通過ERK通路調(diào)節(jié)正常人和銀屑病表皮角質(zhì)形成細胞的整合素α5和β4的表達：U0126能夠減少正常人表皮角質(zhì)形成細胞的整合素α5的蛋白表達，而對β4的表達無影響。相反地，在銀屑病角質(zhì)形成細胞中，U0126能夠明顯減少整合素β4的蛋白表達，而對α5的表達影響不大。U0126預處理的正常人表皮角質(zhì)形成細胞中，IL

12、-13、ET-1能夠使α5表達增加；IL-17A、TNF-α和IFN-γ能夠顯著增加α5的表達。而IL-13、IL-17A和IFN-γ會減少β4的蛋白表達；但是ET-1和TNF-α能夠增加其表達。U0126預處理的銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細胞中，IL-13、IL-17A能夠顯著增加α5表達；而IFN-γ能夠減少其表達；ET-1和TNF-α對α5表達無影響。IL-13、IL-17A可以增加β4的蛋白表達；ET-1、TNF-α和IFN-γ對該

13、蛋白的表達無影響。
　　 2、鈣離子和地塞米松對正常皮膚及硬皮病、銀屑病皮損成纖維細胞中FN，CTGF，col-1A的調(diào)節(jié)作用
　　 1)在正常成纖維細胞中，ca++對FN和CTGF都有很強的促進作用，對col-1A的影響不大。而在硬皮病和銀屑病的成纖維細胞中，Ca++對FN，CTGF和col-1A均有促進作用。
　　 2)證明ERK，Rho，p53和Smad2信號通路都與Ca++對成纖維細胞的影響相關(guān)。

14、　　 3)在dex實驗中發(fā)現(xiàn)，正常成纖維細胞中，dex對FN和col-1A均有抑制作用；但是對CTGF卻有促進作用。而在硬皮病和銀屑病成纖維細胞，dex對上述三種ECM蛋白均有誘導產(chǎn)生的作用。
　　 4)證明ERK，Rho，p53和Smad2信號通路都與dex對成纖維細胞的影響相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 1、整合素α5在正常人和硬皮病患者表皮除角質(zhì)層外的各層具有表達，基底層和鄰近基底層的棘細胞層(暫時擴增細胞)表

15、達較強，而在銀屑病表皮的基底層和棘細胞層均勻表達，為強陽性；
　　 2、整合素β4表達于正常人和硬皮病患者表皮各層，在基底層表達極弱。β4在正常人表皮細胞的胞膜和胞漿均有表達，在硬皮病患者表皮僅在胞膜表達。銀屑病患者表皮的角質(zhì)層和基底層不表達β4；
　　 3、體外培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細胞α5蛋白質(zhì)表達：和正常角質(zhì)形成細胞相比，硬皮病皮損角質(zhì)形成細胞中α5表達下降，但無顯著性差異。而在銀屑病皮損角質(zhì)形成細胞中表達明顯增高，且

16、有顯著性差異；
　　 4、體外培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細胞β4蛋白質(zhì)表達：和正常角質(zhì)形成細胞相比，硬皮病皮損角質(zhì)形成細胞β4表達明顯減少，有顯著性差異。而在銀屑病皮損角質(zhì)形成細胞中表達雖然下降，但無顯著性差異；
　　 5、接受同種細胞因子刺激后，正常皮膚和硬皮病、銀屑病皮損角質(zhì)形成細胞的整合素α5和β4調(diào)節(jié)各不相同；
　　 6、鈣離子可能在硬皮病和銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用；
　　 7、地塞米松對硬皮病和銀屑病