miR146a在肺成纖維細胞表型轉化中的作用和機制.pdf

1、目的：
　　本研究通過小鼠肺纖維化造模，體外培養(yǎng)小鼠肺成纖維細胞，TGF-β1（transforming growth factor-β1）刺激肺成纖維細胞發(fā)生表型轉化后，蛋白質印跡法（Western-blotting，WB）、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測在不同轉化程度中腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNF rece

2、ptor associated factor6，TRAF6）蛋白、microRNA-146a（miR146a）的動態(tài)表達變化，以探討miR146a在肺成纖維細胞表型轉化中的的作用機制。
　　方法：
　　1、將40只小鼠隨機分為兩組：對照組、博來霉素肺纖維化組（模型組）；對照組予以氣管內灌注生理鹽水，模型組則氣管內滴注博來霉素溶液（2.5mg/kg），于造模后第4周處死小鼠。
　　2、采用肺組織蘇木精一伊紅染色法（hem

3、atoxylin-eosin staining,HE染色）的方法來驗證纖維化模型是否構建成功；
　　3、肺成纖維細胞的培養(yǎng)和鑒定，用細胞貼壁法結合胰酶法獲得肺成纖維細胞，在倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)和數(shù)量的變化，并拍照記錄以及免疫細胞組織化學染色測定成纖維細胞表面標記物兩種方法鑒定肺成纖維細胞；
　　4、將細胞分成四個組，標記為A（空白對照組）、B、C、D組，分別用濃度為0、5、10、15ug/l的TGF-β1刺激肺成纖維細胞發(fā)

4、生表型轉化，用WB檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）TRAF6蛋白的表達，qRT-PCR法檢測細胞中miR146a的相對表達量。
　　結果：
　　成功構建博來霉素誘導的小鼠肺纖維化小鼠模型，成功培養(yǎng)出肺成纖維細胞，并用TGF-β1進行誘導24小時。
　　1、隨著TGF-β1濃度的提高，α-SMA蛋白、TRAF6蛋白的表達均呈濃度依賴性增高，四組細胞的α-SMA蛋白、TRAF

5、6蛋白表達有統(tǒng)計學意義：（（TRAF6）F=41.25；（a-SMA）F=150.04，P＜0.01， P＜0.05）；
　　2、四組間miR146a基因的表達有統(tǒng)計學意義（F=335.00，P＜0.01， P＜0.05），無TGF-β1刺激時，miR146a呈低表達，B組TGF-β1濃度為5ug/l刺激下的表達最高，然后呈濃度依賴性下降趨勢；
　　3、在TGF-β1誘導下的肺成纖維細胞表型轉化率越高（α-SMA表達越高），