色氨酸羥化酶-2在大腸桿菌中的表達(dá)及其畢赤酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建.pdf

1、5-羥基色氨酸(5-HTP)是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)的前體物,是腦部控制情緒、行為、睡眠、食欲的重要化學(xué)物質(zhì)。5-HTP不僅成功的應(yīng)用于抗抑郁、失眠的治療上,也可有效幫助產(chǎn)生飽足感,從而降低食欲,具有一定的減肥功效。
　　 色氨酸羥化酶-2(TPH-2)是5-HT合成過(guò)程中的限速酶,直接催化色氨酸生成5-HTP。本研究首次通過(guò)外源表達(dá)獲得了TPH-2蛋白,具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值并可能成為工業(yè)生產(chǎn)5-HTP的新

2、的重要途徑。
　　 本研究主要致力于來(lái)源于人的TPH-2基因在大腸桿菌表達(dá)體系中的表達(dá)及在畢赤酵母表達(dá)體系中表達(dá)載體的構(gòu)建整合。研究中構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a-TPH、PGEX-4T-1-TPH和畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα-TPH和pPIC3.5k-TPH,并分別在大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)體系和畢赤酵母表達(dá)體系中進(jìn)行了重組蛋白表達(dá)的研究。在大腸桿菌表達(dá)體系中,通過(guò)兩個(gè)載體分別成功的首次表達(dá)出了具有his標(biāo)簽的融合蛋

3、白和具有Gst標(biāo)簽的融合蛋白。在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中,也首次成功的將目的基因整合至畢赤酵母基因組中,構(gòu)建了穩(wěn)定的外源蛋白表達(dá)的工程菌。
　　 在微物轉(zhuǎn)化色氨酸生產(chǎn)5-HTP的研究中,篩選了40株霉菌、十余株放線菌及從加納籽中分離純化的未知菌株。首先通過(guò)分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法在微生物生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期添加底物進(jìn)行底物轉(zhuǎn)化,同時(shí)為防止微生物自身代謝體系對(duì)底物色氨酸的利用,通過(guò)使用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行了微生物轉(zhuǎn)化,此種方法可以減少因微生物自身代謝而消

4、耗的色氨酸。即將培養(yǎng)后的微生物離心獲得菌體,將菌體分散在含有底物的生理鹽水中進(jìn)行對(duì)底物的轉(zhuǎn)化。通過(guò)兩種微生物轉(zhuǎn)化色氨酸生成5-HTP方法的研究,初步探索了微生物轉(zhuǎn)化色氨酸生產(chǎn)5-HTP的能力,為后人開(kāi)展生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)5-HTP奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了深入研究5-HTP的生理功能,開(kāi)展了通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證5-HTP抑制食欲,幫助減肥的功能的研究。通過(guò)與陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照的比較,小鼠每天兩次,在喂食前一小時(shí)每次灌胃0.5mL濃度為0.1