酵母甘油合成關鍵酶基因在大腸桿菌中的表達研究.pdf

1、酵母中普遍存在葡萄糖到甘油代謝途徑，對釀酒酵母的研究表明，葡萄糖分解生成磷酸二羥丙酮(DHAP)，DHAP在關鍵酶NAD+依賴性3-磷酸甘油脫氫酶(GPD)催化下還原為3-磷酸甘油。3-磷酸甘油在3-磷酸甘油酯酶(GPP)的作用下脫磷酸根而形成甘油。這兩個酶分別有兩個同工酶，其中GPD1和GPP2受滲透壓誘導高表達。
　　 產甘油假絲酵母WL2002-5具有耐高滲且高產甘油的特性，本課題組已通過染色體步移法首次成功克隆了來源于產

2、甘油假絲酵母的胞漿3-磷酸甘油脫氫酶編碼基因CgGPD1，通過基因序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因是全新的基因，有關該酶的酶學性質的研究未見報道，為了能更好的解釋該酶在高滲條件下保持高酶活和產甘油假絲酵母的耐高滲甘油合成的代謝機理，因此對該酶的酶學性質的研究顯得十分迫切。
　　 在前期研究的基礎上，首先，本課題以產甘油假絲酵母基因組DNA為模板，擴增得到3-磷酸甘油脫氫酶編碼基因CgGPD1，將其克隆到大腸桿菌表達載體pET-28a(+)上

3、，在E.coliBL21(DE3)中誘導表達，利用表達載體pET-28a(+)上的6His·Tag標記選用N12+柱純化具有表達活性的3-磷酸甘油脫氫酶(CgGPD1)，純化后比酶活達到152.6mU/mg，并初步研究了該酶的酶學性質并與釀酒酵母3-磷酸甘油脫氫酶ScGPD1的酶學性質進行了比較。研究發(fā)現(xiàn):兩種蛋白分子量大小基本相同，CgGPD1的最適pH為6.2，而ScGPD1為6.8；CgGPDl在pH3.5-7.5范圍內穩(wěn)定性良好

4、，ScGPD1在pH4.5-6.2范圍內穩(wěn)定；CgGPD1最適溫度為25℃，ScGPD1為37℃；二者均在-20℃表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性；CgGPD1受Mg2+激活明顯，受Zn2+完全抑制，進一步通過在產甘油假絲酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中單獨添加這兩種離子來指導甘油發(fā)酵，ScGPD1同樣受Mg2+激活，受Zn2+完全抑制；以DHAP為底物CgGPD1的Km值為0.55mmol/L，Vmax為1.06umol/(mg/nun)，ScGPD1的Km值為0

5、.75mmol/L，Vmax為0.51umol/(mg/min)。
　　 其次，本研究從釀酒酵母中擴增了3-磷酸甘油酯酶編碼基因GPP2(ScGPP2)，構建重組菌株pET28a-ScGPP2/BL21，在大腸桿菌中對ScGPP2進行誘導表達、純化和酶學性質的初步研究。研究發(fā)現(xiàn)，ScGPP2大小約為31KDa，最適pH為4.5，在pH5.5-7.5范圍內具有較好的穩(wěn)定性；最適溫度為55℃，在4℃和-20℃均有較好的穩(wěn)定性，受到M

6、g2+和Fe3+的激活，而Zn2+、Sn2+、Mn2+離子對該酶呈完全抑制狀態(tài)；以不同濃度的3-磷酸甘油為底物，測得該酶的Km值為0.55mmol/L，Vmax為0.30umol/(mg/min)。以3-磷酸甘油為底物，進行菌株pET28a-ScGPP2/BL21的全細胞轉化，證明了該酶良好的轉化性能，該酶能有效的將底物3-磷酸甘油轉化為甘油。
　　 最后，我們在大腸桿菌中嘗試了葡萄糖到甘油代謝途徑的重構。即將基因CgGPD1和