骨髓間充質(zhì)干細胞對幼鼠慢性腎功能不全的修復(fù)作用.pdf

1、目的：
　　探討同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞(BoneMesenchymal Stem Cells,BMSCs)移植對幼鼠慢性腎功能不全(Chronic Renal Insufficiency,CRI)的修復(fù)作用。
　　方法：
　　1、骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記：取體質(zhì)量為40~60g雄性Wistar幼鼠，3％水合氯醛麻醉后斷頸處死，75%酒精浸泡消毒15分鐘，待酒精滴瀝片刻，置于無菌手術(shù)彎盤中分離出全骨髓

2、，用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合密度離心法培養(yǎng)種子細胞BMSCs，取生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs，用流式細胞儀(Flow cytometer，F(xiàn)CM)檢測CD45抗原和CD90抗原陽性表達情況；用成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液及成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)BMSCs向脂肪細胞及成骨細胞分化，鑒定其多向分化潛能；用DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)標(biāo)記BMSCs。
　　2、實驗動物分組及造模：取體質(zhì)量為91±12g

3、、生長狀況良好的雄性Wistar幼鼠90只，隨機為3組：A組：BMSCs治療組，35只；B組：模型組，35只；C組：正常對照組，20只。A、B兩組幼鼠每日同一時間點給予腺嘌呤100mg/(kg?d)灌胃，建立幼鼠CRI模型。C組幼鼠灌胃予等體積蒸餾水作為對照。上述處理共5周。
　　3、BMSCs修復(fù)幼鼠CRI：造模24小時，所有幼鼠尾部用醫(yī)用酒精棉球消毒，可見皮下血管明顯擴張，作如下處理：A組幼鼠用留置針抽取1mlDAPI-BMS

4、Cs(1x106)經(jīng)擴張的尾靜脈植入；B、C兩組幼鼠用留置針抽取1mlPBS緩沖液，經(jīng)幼鼠擴張尾靜脈植入。于治療后第3天、7天、14天、28天、42天時，從A、B兩組幼鼠中隨機抽取6只，C組幼鼠隨機抽取3只，3%水合氯醛麻醉，頸靜脈取血標(biāo)本，檢測腎功能變化血清學(xué)指標(biāo)；放入代謝籠留取24小時尿標(biāo)本進行尿蛋白定量檢測；腎臟組織經(jīng)中性甲醛固定后，制造切片行HE和PAS染色，記錄三組幼鼠切片組織學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　1、骨髓間充

5、質(zhì)干細胞體外分離、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記：第三代BMSCs為排列均勻、包體中間粗、兩端較細的紡錘形；FCM多次檢測顯示BMSCs表面CD90抗原陽性,CD45抗原陰性；成脂及成骨誘導(dǎo)分化后，經(jīng)相應(yīng)染色分別可見紅色脂滴及紅色鈣化結(jié)節(jié)形成；DAPI標(biāo)記種子細胞核為圓形，發(fā)藍色熒光，標(biāo)記率接近100%。
　　2、CRI模型建立：A、 B兩組大鼠給予腺嘌呤100mg/(kg?d)連續(xù)灌胃5周時，與C組大鼠相比，表現(xiàn)為對外來刺激反應(yīng)明顯遲鈍，無精

6、打采，飲食量明顯低于C組，尿量多，毛發(fā)干枯脫落。隨機抽取各組幼鼠3只，留取血、尿標(biāo)本檢測腎功能變化指標(biāo)(BUN、Cr、尿蛋白定量)，均較C組明顯升高，P<0.05，造模成功。
　　3、BMSCs修復(fù)幼鼠慢CRI：腎臟功能學(xué)變化：細胞移植治療28天時，A、B兩組間血清腎臟功能學(xué)指標(biāo)無明顯差別；42天時，A組上述指標(biāo)較B組降低，P<0.05,結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。腎臟組織學(xué)變化：細胞移植治療28天時，A、B兩組大鼠腎組織無明顯差別，腎小球

7、主要表現(xiàn)為體積肥大，球囊擴張，炎細胞浸潤；腎小管損傷嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為輪廓不清，管間排列紊亂，管腔及間質(zhì)大量淡黃色尿酸結(jié)晶沉積，腎小管上皮細胞腫脹、裂解、壞死，間質(zhì)炎癥細胞浸潤明顯；未見局部腎小球硬化及間質(zhì)纖維化；42天時，A組腎小管輪廓較B組清晰、規(guī)則，尿酸結(jié)晶沉積減少，上皮細胞腫脹減輕，炎癥細胞浸潤減少，P<0.05,結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、采用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合密度離心法可培養(yǎng)干細胞特性保持較為完整的BMS