簡介：誘導產(chǎn)生多能性干細胞的研究,里程碑式的科學突破,細胞重編程的研究概況,核移植,核移植試驗最初是在兩棲動物中實現(xiàn)的，通過將體細胞核注入到去核卵母細胞中。迄今，人們已經(jīng)獲得了多種核移植動物，也建立了來源于核移植胚胎的胚胎干細胞系。,體細胞核移植試驗也具有很大的局限性,克隆的效率極低產(chǎn)生的許多后代在各個階段都體現(xiàn)出嚴重的發(fā)育異常由于需要卵母細胞，核移植實驗在人類中的應(yīng)用受到強烈的倫理學質(zhì)疑這些不足，都制約了核移植技術(shù)的進一步發(fā)展和應(yīng)用。,將成熟的體細胞與多潛能的細胞（ES細胞、胚胎癌細胞等）融合，或者用胚胎干細胞提取物來處理體細胞，也可以在一定程度上使體細胞發(fā)生重編程。,利用這兩種方法，可以實現(xiàn)某些多功能性標志分子的重新表達和多種分化潛能的獲得。但是，體細胞與多能性細胞的融合率較低，融合之后的細胞具有兩套染色體，并且在移植后會發(fā)生排斥現(xiàn)象，這就制約了細胞融合的臨床應(yīng)用。,有沒有相對簡單，又可擺脫材料來源和倫理學諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢,里程碑式的科學突破,2006年11月20日，日本京都大學的山中伸彌（SHINYAYAMANAKA和美國威斯康星大學的詹姆斯湯姆森（JAMESTHOMSON）分別在細胞和科學雜志上發(fā)表重量級論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類體細胞改造成了類胚胎干細胞，在功能上幾乎可以和胚胎干細胞相媲美。,詹姆斯湯姆森小組的論文發(fā)表在11月20日的科學雜志上,俞君英是11月20日科學雜志論文的第一作者,2006年8月，日本科學家山中伸彌小組首先在小鼠身上取得成功,誘導產(chǎn)生的多功能性干細胞,2006年，TAKAHASHI和YAMNAKA將幾個轉(zhuǎn)錄因子導入已分化的小鼠皮膚成纖維細胞，進而獲得了類似于胚胎干細胞的多能性干細胞，稱之為“誘導產(chǎn)生的多功能性干細胞”（INDUCEDPLURIPOTENTSTEMCELLS,IPS細胞）。這一研究明確地證實了分化的細胞可以通過少數(shù)幾個因子的外源導入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)，因而受到了整個生命科學領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。,在研究誘導多功能性干細胞產(chǎn)生的原理機制之前，先了解一下體細胞重編程逆轉(zhuǎn)為干細胞的研究進展,體細胞重編程的過程體細胞重編程的原理體細胞不經(jīng)過胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細胞的方法,成體細胞核的重編程,1核重編程核移植后供體核停止本身的基因表達程序，恢復(fù)為胚胎發(fā)育所必需的胚胎化基因表達程序狀態(tài)。此過程包括染色體結(jié)構(gòu)重建、DNA甲基化、組蛋白乙酰化、印記基因表達、端粒長度恢復(fù)、X染色體失活等。,,11DNA甲基化12合子型基因的重新激活，如OCT42重塑核結(jié)構(gòu)主要有包括核纖層A、B、C三種核纖層蛋白的重塑,,,3細胞質(zhì)重編程MIRNA,MIRNA是決定細胞分化方向的因子。細胞中MIRNA成分的改變能提高細胞對調(diào)節(jié)基因表達重編程。,,接下來，介紹一下體細胞重編程不經(jīng)過胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細胞的方法之一通過特定基因的表達將體細胞重編程過程逆轉(zhuǎn)為干細胞?！盎蛑匦戮幣偶夹g(shù)”，借助“逆轉(zhuǎn)錄酶病毒”為載體,即向皮膚細胞中植入一組4個基因OCT4,SOX2,CMYC和KLF4，通過基因重新編排，使皮膚細胞具備胚胎干細胞的功能。這種被改造過的細胞稱作“IPS細胞”。,,下面簡單介紹一下這些研究中所用到的多能性相關(guān)因子OCT4,SOX2,CMYC和KLF4在多能性調(diào)控中的作用。,1OCT3/4,OCT4（也稱OCT3）屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員13。是哺乳動物胚胎發(fā)育的一個關(guān)鍵的調(diào)控因子。是全能性的標志，它能夠促使ICM形成、維持胚胎干細胞未分化前狀態(tài)并促進其增殖。,2SOX2基因,SOX2基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的主控基因（MASTERGENES）家族的一個成員。轉(zhuǎn)錄因子是些與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)其他基因表達的蛋白質(zhì),3癌癥基因CMYC,癌癥基因CMYC，是一種最容易過渡表現(xiàn)于人類的致癌基因，它對某些成體干細胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES細胞的分化。,4KLF4,KRUEPPELLIKEFACTOR4，KLF4上皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子KLF4舊稱GKLF調(diào)節(jié)體外細胞的增生與分化,IPS細胞誘導機制,,已分化的細胞,,導入病毒基因OCT3/4、SOX2、CMYC和KLF4,病毒逆轉(zhuǎn)錄,,胚胎干細胞培養(yǎng)條件和篩選,IPS細胞,誘導多功能細胞,,,,,我們已經(jīng)了解了體細胞重編程的原理和誘導多功能干細胞的產(chǎn)生機制，下面讓我們再深入了解一下IPS細胞的研究概況和IPS細胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)。,IPS細胞的研究概況（研究方法）,這是一種具有很強創(chuàng)新性的研究方法通過外源導入與多功能相關(guān)并且能使重組細胞恢復(fù)全能性的轉(zhuǎn)錄基因來誘導體細胞核發(fā)生重新編程，從而使體細胞轉(zhuǎn)變成多能性干細胞。,這種方法所受的啟示來源于“ES細胞體細胞融合實驗”。細胞的多能性收到許多因子精密而又復(fù)雜的調(diào)控。ES細胞和體細胞融合后能誘導體細胞核的重新編程，ES細胞中存在著一些因子，這些因子對于多能性的建立可能至關(guān)重要。,,,IPS細胞的研究概況（兩個相關(guān)實驗）,IPS細胞首先由科學家TAKAHASHI和YAMANAKA在2006年建立的。實驗原理如下利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在小鼠成纖維細胞中導入了4個與多功能性有關(guān)的基因OCT4,SOX2,CMYC和KLF4。利用多能性標志分子FBX15的表達對轉(zhuǎn)染后的細胞進行了篩選，最終的到了IPS細胞，這種細胞的功能和性能幾乎和胚胎干細胞一樣。,另一個實驗的對象是人類皮膚成纖維細胞的重編程，而實驗的過程和上一個實驗基本相同；。只是對所篩選的轉(zhuǎn)錄基因做了一下修飾去掉了腫瘤相關(guān)因子CMYC，使IPS細胞的生產(chǎn)更加安全,IPS細胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)（幾種因子的發(fā)現(xiàn)過程）,日本科學家發(fā)現(xiàn)ES細胞中那個存在著一些因子，這些因子對于多能性的建立可能至關(guān)重要?？茖W家對24個與多能性維持相關(guān)的候選基因?qū)胄∈蟪衫w維細胞中，依次去掉其中一個基因，最后在得到的10個基因中發(fā)現(xiàn)了4個至關(guān)重要的基因，其中任何一個缺失都將導致實驗的失敗，這4個基因中的任意2個或3個組合都無法形成具有ES細胞特性的IPS細胞。從而確定了OCT4,SOX2,CMYC和KLF4這4種基因,人類ES細胞能夠通過細胞融合實驗室體細胞發(fā)生重編程。美國科學家比較了人類ES細胞和髓前體細胞的基因表達譜，挑選出許多在ES細胞和髓前體細胞的基因表達譜，挑選出許多在ES細胞中相對高表達的基因。再根據(jù)這些基因在多能性調(diào)控中的已知功能對其進行了排序，從中選出14個候選基因。將這些基因以不同的組合方式導入一種由人類ES細胞分化得到的間充質(zhì)樣細胞后，檢驗了不同基因的導入對這種細胞重編程的作用。最后鎖定了4種因子OCT4,SOX2,NANOG,LIN28,IPS細胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)（IPS細胞的篩選）,IPS細胞的篩選主要有三種方法形態(tài)學篩選、藥物篩選和選用對多能性更為關(guān)鍵的基因作為報告基因。其中利用FBX15對IPS細胞進行篩選，原理是FBX25對于多能性的維持和胚胎的發(fā)育來說是不可缺少的基因，所以FBX25作為篩選IPS細胞的報告基因。僅利用形態(tài)學的標準來代替報告基因的篩選。MAHERALI等人發(fā)現(xiàn)，僅僅依靠形態(tài)學篩選可能就足以建立IPS細胞系。后來的研究證實了在不對供體細胞做任何額外遺傳修飾的情況下，僅依靠形態(tài)學篩選的標準對細胞進行篩選也能夠分離出小鼠的IPS細胞。利用基因重組技術(shù)建立了具有藥物抗性基因的體細胞，這些細胞的抗性受內(nèi)源性NANOG或OCT4表達的調(diào)控。這兩個基因的作用是維持細胞多能性，從而利用這種篩選的方法建立了穩(wěn)定的IPS細胞系，這些細胞系在各個方面都表現(xiàn)出了極為相似的特性。,IPS細胞的應(yīng)用價值和發(fā)展方向,1、利用IPS細胞作為實驗?zāi)Ｐ?，只操縱幾個因子的表達，加速對多能性調(diào)控機理的深入研究。2、獲得的方法相對簡單穩(wěn)定，不涉及胚胎的破壞，無倫理道德限制。3、對于疾病機理研究和新藥開發(fā)等方面將有很大貢獻。4、可望制造特定病人來源的IPS細胞，用“個性化”移植來治療諸多疾病。,誘導性多能干細胞用于治療小鼠帕金森病,美國麻省WHITEHEAD生物醫(yī)學研究的WERNIG等近日報告,通過OCT4、SOX2、KLF4和CMYC四種轉(zhuǎn)錄因子誘導出的IPS細胞可分化成神經(jīng)細胞,可改善帕金森病小鼠的運動功能。,研究者首先檢驗了IPS細胞在體外的分化能力,發(fā)現(xiàn)IPS細胞可以分化成神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞,并且能夠進一步生成神經(jīng)元亞型細胞,,,未分化的IPS細胞,IPS細胞在體外分化成神經(jīng)細胞,隨后,研究者用熒光物質(zhì)標記IPS細胞,將其入注射入胚胎小鼠的腦室內(nèi)。9周后小鼠出生后,研究者發(fā)現(xiàn),IPS細胞可遷移到小鼠腦的各個區(qū)域。,包括腦膜、紋狀體、下丘腦、中腦等部分,并且可分化成神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元,包括谷氨酸性突觸、Γ氨基丁酸能神經(jīng)元和兒茶氨酚能神經(jīng)元等亞型,因為這些分化出的細胞具有神經(jīng)細胞的形態(tài),并且表達其特異的標志物,IPS細胞植入小鼠大腦后的分布情況,IPS細胞分化的細胞具有神經(jīng)細胞形態(tài),IPS細胞分化的細胞表達神經(jīng)細胞特異標志物,電生理記錄和形態(tài)學分析表明,IPS細胞分化出的神經(jīng)元細胞植入小鼠體內(nèi)后,具有神經(jīng)元和突觸的形態(tài),參與小鼠的電生理活動，因而可增強受植小鼠大腦的神經(jīng)元活性并參與腦功能。,IPS細胞分化出的神經(jīng)元細胞可發(fā)生膜電位改變,研究者對小鼠大腦一側(cè)注射神經(jīng)毒性物質(zhì)6羥基多巴胺,使該側(cè)內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的神經(jīng)元死亡。這可破壞該側(cè)大腦紋狀體,即大腦中負責運動控制的區(qū)域,模擬了帕金森病發(fā)生時的情況。經(jīng)過這樣處理的小鼠運動控制功能受損,因此無法保持平衡而持續(xù)旋轉(zhuǎn)。,接著，研究者對IPS細胞進行特殊處理,確保這些IPS分化成為多巴胺能神經(jīng)元,將其植入小鼠大腦運動功能受損的一側(cè)接受6羥基多巴胺注射的一側(cè)。幾周后研究者發(fā)現(xiàn),10只受移植的小鼠中有9只的運動功能得到顯著改善，其中甚至有1只小鼠受損側(cè)的運動功能好于未受損側(cè)。,IPS細胞研究中存在的問題,1、腫瘤相關(guān)基因，如CMYC的使用，有誘發(fā)癌癥的可能2、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染可能會導致一些癌基因的激活，也可能導致某些重要基因功能受阻。3、基因表達模式與ESC還存在一些不同。4、效率較低，重組率只有01。,總結(jié),,組內(nèi)同學的分工,細胞重編程概況部分演講（陳宇翰），資料（林曉鋒），圖片（梁樂）體細胞重編程逆轉(zhuǎn)為干細胞以及誘導多功能干細胞誘導機制部分演講（劉曉暉），資料（余炳強），圖片（林偉鈿）IPS細胞的研究概況和IPS細胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)部分演講（王珩），資料（林澤江），圖片（羅熙文）IPS細胞的應(yīng)用價值和發(fā)展方向部分演講（吳逸希）,問答時間,
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