銅（Ⅱ）鎘（Ⅱ）、幾種小分子同血清白蛋白的相互作用研究.pdf

1、蛋白質是細胞內的功能分子，在所有的生命過程中起著關鍵的作用，具有運載和儲存功能，其特定結構與其生物功能密切相關。血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質，它由一條單獨的氨基酸多肽鏈構成，其三級結構主要為α-螺旋結構，其中包含3個結構域，即domain Ⅰ、domain Ⅱ和domain Ⅲ。每個結構域包含A、B兩個亞區(qū)，以槽口相對的方式形成一種圓筒狀結構。其中位于domain Ⅱ和domainⅢ的Site Ⅰ和Site Ⅲ兩個結合位點與許多小分

2、子化合物具有較強結合能力，能夠與許多內源性物質和外源性物質結合，起到存儲和轉運的作用。血清白蛋白具有許多重要的生理功能，可與許多化學物質(如金屬離子、脂肪酸、氨基酸、激素、藥物及污染毒物等)以不同方式結合，并攜帶著這些物質通過血液在體內進行轉運、運輸、分配和代謝。通過研究化學物質與血清白蛋白相互作用，可獲取化學物質在體內被轉運、分配和代謝過程的重要信息。在金屬離子、藥物藥理和毒理研究、污染毒物的危害機理及基因變異研究等方面具有重要意義。

3、該領域已經成為從事生命科學、化學、臨床醫(yī)學科研工作者共同關注的課題之一。本論文基于開展小分子與蛋白質相互作用的重要意義及國內外研究趨勢，在前人工作的基礎上，綜合利用熒光光譜、紫外一可見吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜((FTIR)、同步熒光光譜和三維熒光光譜，從以下幾方面進行了研究： 在第一章的緒論中介紹了五個方面的內容：1．概述；2．小分子與蛋白質相互作用的研究方法；3．小分子與蛋白質相互作用獲取的信息；4．小分子與蛋白質相互作用

4、的研究現狀；5．立題依據和研究內容。重點介紹了小分子與蛋白質相互作用的研究方法和手段及能夠獲取的信息。闡述了本論文的目的和意義，并對該方面未來的發(fā)展進行了預測和展望。 在第二章中在模擬生理條件下利用紫外光譜法和熒光光譜法研究了Cu(Ⅱ)與牛血清白蛋白的相互作用。利用熒光光譜法研究了不同溫度下Cu(Ⅱ)對牛血清白蛋白的猝滅情況，采用Stem-Volmer方程和Lineweaver-Burk雙倒數方程對數據進行處理，并利用熱力學公式

5、推導了兩者之間的相互作用力。研究中發(fā)現，Cu(Ⅱ)對牛血清白蛋白BSA的內源熒光猝滅以靜態(tài)猝滅為主，二者之間生成了不發(fā)熒光的復合物是導致熒光猝滅的主要原因。Cu(Ⅱ)——牛血清蛋白相互作用過程是一個熵增加、吉布斯自由能降低的自發(fā)超分子作用過程，二者之間的作用力以疏水作用力為主。Cu(Ⅱ)會導致血清蛋白色氨酸殘基和酪氨酸殘基附近微環(huán)境極性增加，疏水性略有降低，使得牛血清白蛋白的肽鏈伸展，α-螺旋含量減少。紫外光譜法進一步驗證了Cu(Ⅱ)與

6、牛血清白蛋白之間的相互作用。通過改變激發(fā)波長，采用熒光光譜法研究了Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對人血清白蛋白和牛血清白蛋白上的2種熒光基團的猝滅情況及結合位點，紫外光譜法研究了二者共存時與血清白蛋白共有的結合位點的競爭。研究中發(fā)現，Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對血清白蛋白的色氨酸殘基和酪氨酸殘基均具有猝滅作用，Cu(Ⅱ)的猝滅程度遠遠強于Cd(Ⅱ)。Cu(Ⅱ)只與血清蛋白中214位色氨酸殘基發(fā)生作用，而Cd(Ⅱ)除了與血清白蛋白的214位發(fā)生作用外

7、，還和牛血清蛋白獨有的135位色氨酸殘基發(fā)生作用。Cu(Ⅱ)與Cd(Ⅱ)同時存在時Cu(Ⅱ)與牛血清白蛋白的結合占主導作用。在第三章中在模擬生理條件下利用紫外光譜法和熒光光譜法研究了雜多酸鹽K<,7>[PTi<,2>W<,10>O<,40>]·6H<,2>O(PM-19)與牛血清白蛋白和人血清白蛋白的相互作用。利用熒光光譜法研究了不同溫度下PM-19對兩種血清蛋白的猝滅情況，采用Stem-Volmer方程和Lineweaver-Burk

8、雙倒數方程和雙對數方程對數據進行處理，獲取了結合常數和結合位點數。并利用熱力學公式研究了PM-19與蛋白作用的熱力學參數及主要作用力類型。采用F6rster非輻射能量轉移理論計算了PM-19與牛血清白蛋白和人血清白蛋白結合時結合位置與蛋白質分子中熒光發(fā)射基團之間的距離。采用同步熒光光譜法探討了PM-19對血清蛋白構象的影響。研究中發(fā)現PM-19對血清蛋白的內源熒光具有強烈的猝滅作用，靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉移是導致血清蛋白的內源熒光猝滅的

9、主要原因。PM-19和血清蛋白形成的復合物的結合常數在10<'4>-10<'6>L·mol<'-1>，表明兩者的結合較穩(wěn)定，說明PM-19可被血清蛋白存儲和運輸。與牛血清白蛋白和人血清白蛋白的結合位點數分別為0.89和0.85。PM-19與牛血清白蛋白之間的主要作用力為靜電作用力；PM-19與人血清白蛋白之間的主要作用力為氫鍵和范德華力。PM-19與牛血清蛋白的結合距離為為4.14nm；PM-19與人血清白蛋白中色氨酸殘基結合位置距離為

10、4.21nm。PM-19與血清蛋白的作用點位靠近色氨酸殘基，二者結合并不影響血清蛋白中熒光基團色氨酸殘基和酪氨酸殘基附近的微環(huán)境，并不改變血清蛋白的構象。 在第四章中，采用紫外、熒光、同步熒光和三維熒光光譜法研究了4-硝基苯胺與血清白蛋白的相互作用。利用熒光光譜法研究了不同溫度下4-硝基苯胺對牛血清白蛋白和人血清白蛋白的猝滅情況，采用Stem-Volmer方程和雙對數方程對數據進行處理，并利用熱力學公式研究了4-硝基苯胺與蛋白作

11、用的熱力學參數及主要作用力的類型。采用Forster 非輻射能量轉移理論計算了4硝基苯胺與牛血清白蛋白和人血清白蛋白結合時結合位置與蛋白質分子中熒光發(fā)射基團之間的距離。采用紫外光譜法探討了4-4硝基苯胺對血清蛋白構象的影響。采用同步熒光光譜法和三維熒光光譜法探討了4-硝基苯胺對血清蛋白構象的影響。研究中發(fā)現4-硝基苯胺與血清蛋白發(fā)生作用生成了新的復合物。其猝滅機理為靜態(tài)猝滅，同時伴隨非輻射能量轉移。確定4-硝基苯胺與血清蛋白有一個結合位

12、點，其結合常數數量級為10<'4>L·mol<'-1>。4-硝基苯胺與血清蛋白相互作用過程是一個熵增加、吉布斯自由能降低的自發(fā)超分子作用過程，二者之間主要靠靜電作用力和疏水作用力結合。4-硝基苯胺與牛血清蛋白的結合距離為3.87nm；4-硝基苯胺與人血清白蛋白中色氨酸殘基結合位置距離為3.76rim。4-硝基苯胺對血清蛋白中的色氨酸和酪氨酸殘基均具有猝滅作用，并使得色氨酸殘基附近極性降低，疏水環(huán)境增強。4-硝基苯胺與血清蛋白的結合位點更

13、接近于色氨酸殘基。三維熒光光譜進一步證明了4-硝基苯胺的加入使血清白蛋白的色氨酸殘基所處的微環(huán)境極性減弱，破壞了血清白蛋白的有序結構，使得整個大分子更趨向于折疊態(tài)。第五章中采用紫外、熒光、同步熒光和三維熒光光譜法研究了2，4-二硝基苯胺與牛血清白蛋白的相互作用。采用熒光方法中常用的Stem-Volmer方程和雙對數方程對數據進行處理。采用Forster非輻射能量轉移理論計算了2，4-二硝基苯胺與牛血清白蛋白結合時結合位置與蛋白質分子中熒

14、光發(fā)射基團之間的距離。采用紫外光譜法研究了不同濃度的2,4-二硝基苯胺對血清蛋白紫外吸收光譜的影響。采用同步熒光光譜法和三維熒光光譜法探討了2,4-二硝基苯胺對血清蛋白構象的影響。研究中發(fā)現2,4-二硝基苯胺與血清蛋白發(fā)生作用生成了新的復合物。其猝滅機理為靜態(tài)猝滅，同時伴隨非輻射能量轉移。確定2,4-二硝基苯胺與BSA的結合位點數為1.17，2,4-二硝基苯胺與牛血清蛋白的結合距離為為3.13nm。2,4-二硝基苯胺對牛血清蛋白中的色氨

15、酸和酪氨酸殘基均具有猝滅作用，并使得酪氨酸殘基附近極性降低，疏水環(huán)境增強。三維熒光光譜進一步證明了4-硝基苯胺的加入破壞了血清白蛋白的有序結構，使得整個大分子更趨向于折疊態(tài)。 第六章中，采用熒光光譜法分別研究了不同溫度下十六烷基三甲基溴化銨CTAB及十二烷基苯磺酸鈉SDBS與牛血清白蛋白的作用。采用紅外光譜法研究了十六烷基三甲基溴化銨對牛血清白蛋白構象的影響。研究中發(fā)現CTAB和SDBS均對BSA內源熒光具有熒光猝滅作用。但兩者