構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細胞檢測親電性化學(xué)污染物的研究.pdf

1、親電性化學(xué)物是指在環(huán)境污染物中一大類可與細胞生物大分子上的親核中心相結(jié)合或可通過生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合的化合物，除可以引起急、慢性中毒外，還可引起腫瘤。親電性化學(xué)物是環(huán)境中的主要污染物，所以越來越引起環(huán)境科學(xué)研究者的高度關(guān)注。 環(huán)境污染物多數(shù)為親電性(Electrophile)化學(xué)物質(zhì)，如TCDD,CdCl2,多氯聯(lián)苯，HgCl2,Pb(C2H3O2)2等。國外許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[1-6]，在哺乳動物細胞中，具有與親電性化學(xué)物發(fā)生反應(yīng)的特

2、異DNA基序(Motif)，稱為親電性物質(zhì)反應(yīng)元件(ElectrophileResponseElement，EPRE)，這一基因的調(diào)控區(qū)基序是非常保守的，調(diào)控下游有關(guān)基因的表達。EPRE可介導(dǎo)多種與機體抗氧化有關(guān)的基因的表達，如γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因，半胱氨酸谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因等，其酶活性的表達程度與親電性化學(xué)污染物對EPRE激活程度有關(guān)，兩者間存在劑量反應(yīng)關(guān)系。 本研究根據(jù)細胞雙雜交原理，分別從p(Gal4)5-TK/C

3、AT和pMT/V5-His擴增TK(胸腺嘧啶)和MT(金屬硫蛋白)基因基本啟動子，分別與蟲熒光素酶報告基因(LUC)相連，將人工合成的親電性化學(xué)反應(yīng)元件(EPRE)插入LUC的上游，構(gòu)建成親電性化學(xué)物調(diào)控的LUC報告載體(pEPRE-TK-LUC和pEPRE-MT-LUC)。用脂質(zhì)體將pERRE-TK-LUC和pEPRE-MT-LUC分別轉(zhuǎn)染于HeLa細胞和昆蟲細胞(Sf9)。用瞬時表達法發(fā)現(xiàn)重組HeLa細胞熒光素酶與親電性化學(xué)物氯化汞

4、、氯化鎘和亞砷酸鈉具有劑量效應(yīng)關(guān)系，而重組Sf9與親電性化學(xué)物無劑量效應(yīng)關(guān)系，這可能是Sf9對親電性化學(xué)物質(zhì)的毒性特別敏感。用G418對重組HeLa細胞進行篩選，陽性細胞經(jīng)順丁烯乙酸二乙酯(DEM)實驗，發(fā)現(xiàn)熒光素酶與DEM間存在劑量效應(yīng)關(guān)系。然而，在正常的pH條件下，底物D-熒光素不能進入細胞，在測定熒光素酶的表達量時，必須通過裂解細胞。由于熒光素酶的催化效率極高，故發(fā)出的光非常短暫(＜10秒)，這為高通量監(jiān)測親電性化學(xué)物的污染程度的