構建轉基因魚類細胞以快速檢測環(huán)境污染物的遺傳毒性.pdf

1、細胞內的p53信號通路可以感受DNA損傷信號，激活并上調胞內p53蛋白的活性和水平，而p53蛋白則誘導一系列與細胞周期停滯、DNA修復和凋亡相關的下游靶基因的表達，從而使細胞周期停滯，給細胞足夠的時間修復DNA損傷；如果DNA損傷太嚴重而無法修復，則誘導細胞凋亡，從而保證了基因組DNA的完整性。周期蛋白依賴性激酶(Cdks)的抑制因子p21(WAF1/Cip1)是p53蛋白的下游靶基因，參與細胞周期停滯的誘導。在本研究中，我們將表達質粒

2、pGL3-p21-luc(人p21基因啟動子驅動的螢火蟲熒光素酶報告基因)和pRL-CMV-luc(CMV強啟動子驅動的海腎熒光素酶報告基因)穩(wěn)定轉染到海水魚牙鲆鰓細胞系FG中，從而成功構建了一種用來檢測環(huán)境污染物或化學藥品的遺傳毒性的轉基因魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)，這種細胞命名為p21FGLuc。當遺傳毒性物質引起p21FGLuc細胞發(fā)生DNA損傷時，螢火蟲熒光素酶的報告基因就會被轉錄激活并表達，而海腎熒光素酶報告基因是組成型表達，起

3、到內對照的作用，降低實驗誤差。因此，該轉基因魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)是利用雙熒光素酶報告基因檢測技術，通過檢測環(huán)境污染物或化學藥品處理后，是否能誘導p21FGLuc細胞的相對熒光信號(螢火蟲熒光信號/海腎熒光信號)提高，來達到檢測遺傳毒性的目的。
　　 本文首先對FG細胞的轉染條件進行了優(yōu)化，結果表明，F(xiàn)G細胞的最佳轉染條件為：轉染試劑Lipofectamine LTX&PLUS最好，對FG細胞的毒性最小，轉染效果最好；24孔板

4、轉染時，DNA總量為500 ng時可以得到最好的轉染效果；在共轉染實驗中，表達質粒與內參質粒在5:1時，熒光蛋白的表達信號最強。
　　 其次，本文將攜帶有人p53基因啟動子驅動的螢火蟲熒光素酶報告基因的質粒和人p21基因的啟動子驅動的螢火蟲熒光素酶報告基因的質粒，分別共轉染到FG細胞中，然后通過DNA損傷試劑博萊霉素(bleomycin)處理共轉染后的FG細胞，并檢測熒光蛋白的表達情況，來確定FG細胞內的p53信號通路的完整性。

5、結果表明，F(xiàn)G細胞具有完整的p53信號通路，表達野生型p53蛋白，而且牙鲆p53的蛋白可以識別人啟動子p21，并激活與這個啟動子相連的螢火蟲熒光素酶基因的表達，這是本文利用該細胞系建立遺傳毒性檢測系統(tǒng)的先決條件。
　　 再次，本文檢測了FG細胞對G418的抗性，確定了G418對轉染后FG細胞進行篩選的最佳濃度是600μg/ml，維持篩選濃度為300μg/ml。并通過G418篩選，將pGL-3-p21-luc質粒、pRL-CMV質

6、粒和pcDNA3.1這三種質粒按照5:1:1的比例共轉染到FG細胞后，得到了穩(wěn)定轉染細胞：p21FGLuc。
　　 最后，本文通過具有不同毒性作用機制的遺傳毒物和非遺傳毒物處理該細胞p21 FGLuc，以驗證該遺傳毒性檢測系統(tǒng)在檢測環(huán)境污染物或化學藥品的遺傳毒性上的特異性、靈敏度和可靠性。結果表明，該遺傳毒性檢測系統(tǒng)，能高效應答遺傳毒物博來霉素(bleomycin)和絲裂霉素C(mitomycin C)對細胞DNA的損傷，并且表

7、現(xiàn)出明顯的劑量效應和時間效應關系，但是對非遺傳毒性物質酒精(ethanol)卻沒有應答反應；對遺傳毒性物質的應答，該系統(tǒng)的反應很迅速，而且在不同的處理時間段內，所誘導的報告基因的表達很穩(wěn)定；在相似的細胞毒性下，博來霉素(bleomycin)處理組的遺傳毒性要高于絲裂霉素C(mitomycin C)處理組。這表明，該轉基因魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)具有很好的特異性。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是一種增塑劑，是目前世界上最廣泛存

8、在的環(huán)境污染物之一。DEHP在細菌、酵母和哺乳動物細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)中以及微核和染色體畸變實驗中，均顯示陰性結果，但是DEHP可引起嚙齒類動物肝臟致癌。本文的p21FGLuc細胞對DEHP的遺傳毒性檢測結果為陽性，首次提供了DEHP具有遺傳毒性的實驗證據(jù)，但是具體作用機制尚待進一步研究。在環(huán)境濃度條件下(0.005μg/ml)，DEHP就可以明顯誘導p21FGLuc細胞的DNA損傷反應，在50μg/ml時，DNA損傷反應達到峰值?？梢?/p>

9、，p21FGLuc系統(tǒng)在檢測DEHP的遺傳毒性上比其它系統(tǒng)要靈敏得多。環(huán)磷酰胺本身沒有致突變作用但是在體內經肝臟代謝后就會產生具有烷化作用的代謝產物，可引起DNA損傷。由于大多數(shù)的細胞不具有代謝活化的能力，因此在體外實驗中，這類間接致突變物需要用S9復合物激活系統(tǒng)對藥物進行處理。本實驗結果表明，環(huán)磷酰胺只有在S9復合物存在的情況下才表現(xiàn)出遺傳毒性。D-甘露醇是一種無遺傳毒性的化學物質，在熒光檢測中沒有引起熒光信號的改變。以上結果表明，該

10、轉基因魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)具有很好的靈敏度。
　　 但是該系統(tǒng)也有個不足之處，丁酸鈉處理該細胞后，可以以不依賴p53信號通路的方式激活p21基因啟動子驅動的熒光蛋白酶的表達，提高了該檢測系統(tǒng)在檢測遺傳毒性時的假陽性率。但是，這一缺陷可通過在p53-/-的細胞中，建立以上調表達p53蛋白為基礎的轉基因細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)來解決。
　　 總之，本研究所構建的轉基因魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)在檢測環(huán)境污染物和藥物的遺傳毒性上