亞歷山大藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒相關(guān)基因的基礎(chǔ)研究.pdf

1、海洋亞歷山大藻屬(Alexamdrium)是一類重要的海洋赤潮甲藻，廣泛分布于北美、歐洲、亞洲海域，其中一半左右能夠產(chǎn)生麻痹性神經(jīng)貝毒。有毒亞歷山大藻引發(fā)的赤潮造成的海水養(yǎng)殖業(yè)損失和人體中毒事件在國(guó)內(nèi)外均有發(fā)生，危害巨大，這就對(duì)亞歷山大藻的生長(zhǎng)，快速識(shí)別鑒定及產(chǎn)毒機(jī)制等研究提出了迫切的要求。 亞歷山大藻藻體較小，不同種(株)形態(tài)相似，缺乏有效的鑒別特征，而利用分子生物學(xué)方法可獲得穩(wěn)定可靠、精確靈敏的識(shí)別指標(biāo)，再與形態(tài)學(xué)識(shí)別鑒定

2、相結(jié)合，可得出可靠、客觀的識(shí)別鑒定結(jié)果。本文在對(duì)分離自中國(guó)青島和廣州海域的3株海洋亞歷山大藻(Alexandrium sp．qdl，Alexandrium sp.qd2，Alexandriumsp.gz)進(jìn)行形態(tài)學(xué)描述的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增獲得了5.8S核糖體基因及其兩側(cè)的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITSl和ITS2，測(cè)序后進(jìn)行了系統(tǒng)學(xué)分析。結(jié)果顯示，Alexandrium sp．gz和Alexandrium sp．qdl與來自韓國(guó)和日本的A.catene

3、lla和來自中國(guó)的兩株可能是A.catenella的藻株AC03和AN0l聚類，并顯示出很高的可信值，這6種(株)藻的遺傳距離值也非常低(<0.02)。因此Alexandrium sp.gz和A1exandrium sp．qdl可能是A.catenella，該種藻廣泛分布于中國(guó)海域，而且具有不同的地理型；Alexandrium sp.qd2與Alexandrium屬的遺傳距離很遠(yuǎn)，而與共生甲藻Symbiodinium californi

4、um，Symbiodinium sp．G15和Gymnodinium sp.Zhao 0l聚類，可信值達(dá)100％。綜合已有的報(bào)道，推斷Alexandrium sp．qd2可能屬于Symbiodinium，并可能是一株?duì)I自由生活的共生甲藻。 在對(duì)Alexandrium sp.qdl做出分類鑒定的基礎(chǔ)上，設(shè)定不同的氮、磷濃度水平，研究在室內(nèi)一次性培養(yǎng)條件下，無機(jī)氮、磷濃度對(duì)鏈狀亞歷山大藻Alexandrium sp．qdl細(xì)胞生長(zhǎng)

5、的影響，結(jié)果表明不同氮磷濃度對(duì)Alexandrium sp．qdl的比生長(zhǎng)速率和穩(wěn)定期生物量均有影響。適當(dāng)?shù)牡拗瓶梢源龠M(jìn)細(xì)胞的分裂，低氮(88.2μmol/L)條件下Alexandrium sp.qdl具有最快的比生長(zhǎng)速率(0.38d<'-1>)，但氮缺乏對(duì)生物量的積累是不利的，因而低氮下生物量明顯偏低；中氮(882μmol／L)條件下，藻細(xì)胞具有最大的生物量和較快的比生長(zhǎng)速率；低磷對(duì)Alexandrium sp.qdl的生長(zhǎng)是極不利

6、的，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率和穩(wěn)定期生物量大大低于磷充足條件；高磷條件下，藻細(xì)胞具有較快的比生長(zhǎng)速率和最大的穩(wěn)定期生物量；隨著培養(yǎng)基中磷濃度(3.6～108μmol／L)的升高，藻細(xì)胞穩(wěn)定期生物量也升高。國(guó)內(nèi)外研究者們發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)特性不僅與環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)鹽濃度有關(guān)，而且與N／P比值有很大關(guān)系，從本實(shí)驗(yàn)可以看出，相對(duì)低的N／P比有利于藻細(xì)胞的分裂繁殖，在低氮中磷(N／P=2.45)和中氮高磷(N／P=8.17)條件下分別得到最大比生長(zhǎng)速率和最大

7、生物量，而高氮中磷(Nr／P=73.5)和中氮低磷(N／P=245)下比生長(zhǎng)速率和生物量均較低。推測(cè)氮磷比24.5可能為該藻對(duì)氮、磷吸收的一個(gè)合理比值。Taroncher-Oldenburg(2000)利用同步化技術(shù)和差異顯示技術(shù)，推測(cè)在A．fundyense甲硫氨酰氨肽酶基因(map)與毒素合成有關(guān)，并認(rèn)為map是表達(dá)上調(diào)基因。本文利用RT-PCR和cDNA末端快速克隆(Rapid Amplificatio of cDNAEnd，RA

8、CE)技術(shù)，克隆了Alexandrium sp．qdl map cDNA的3′端序列，得到三個(gè)map cDNA 3′端序列，可編碼80個(gè)氨基酸。這三條序列在編碼區(qū)完全相同，但在3′端非編碼區(qū)有差異。推測(cè)在Alexandrium sp．qdl中存在兩個(gè)或三個(gè)map基因拷貝，它們分別轉(zhuǎn)錄得到三種map mRNA分子，或者轉(zhuǎn)錄得到兩種map mRNA(mapl和map2)后，由反式拼接或RNA編輯產(chǎn)生第三種map mRNA分子(map3)。S

9、outhern雜交結(jié)果也說明在Alexandrium sp.qdl中最多存在三個(gè)map基因拷貝。 氮磷營(yíng)養(yǎng)元素可以影響藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞的毒素含量和毒素組成。氮限制可造成藻細(xì)胞毒素合成的減少，而相對(duì)充足的氮源對(duì)藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒均有促進(jìn)作用；磷限制能夠?qū)е略寮?xì)胞毒素含量上升?；谶@一點(diǎn)，利用半定量RT-PCR技術(shù)分析了不同氮磷濃度下毒素含量和map表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)map表達(dá)量和藻毒力都是中氮>低磷>低氮>高磷，即藻毒力與map表達(dá)量呈