鏈狀亞歷山大藻環(huán)境條件響應(yīng)基因的篩選及我國北黃海海域微型藻的分離鑒定.pdf

1、隨著全球工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境狀況日益惡化，赤潮頻繁發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)水體富營養(yǎng)化及微量元素是赤潮生物爆發(fā)性生長的因素。但目前為止尚未有報(bào)道把赤潮爆發(fā)的環(huán)境條件和分子生物學(xué)研究聯(lián)系起來，從分子角度揭示赤潮爆發(fā)的內(nèi)在機(jī)制。普遍的研究認(rèn)為，高濃度的磷、錳對(duì)鏈狀亞歷山大藻的生長具有促進(jìn)作用，本研究把利于赤潮生物生長的環(huán)境條件和分子技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建與高磷濃度誘導(dǎo)相關(guān)的鏈狀亞歷山大藻基因表達(dá)抑制性消減文庫，并在錳條件誘導(dǎo)生長細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的驗(yàn)證，使得到

2、的基因片段既與鏈狀亞歷山大藻高磷濃度生長相關(guān)，又與其高錳濃度生長相關(guān)，從而減少藻體對(duì)單一因子的響應(yīng)而產(chǎn)生的假陽性，為獲得赤潮爆發(fā)性生長相關(guān)基因及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為赤潮預(yù)報(bào)和防治提供資料。 經(jīng)對(duì)不同磷濃度條件下鏈狀亞歷山大藻消減文庫的383個(gè)克隆進(jìn)行檢測，獲得348個(gè)陽性克隆，陽性率達(dá)90.9％，后采用兩輪斑點(diǎn)雜交，即將獲得的348個(gè)克隆的PCR產(chǎn)物純化后先與低磷和高磷的cDNA探針進(jìn)行雜交，選取雜交信號(hào)差異在1.4倍以上的克隆

3、，再分別與無錳及高錳的cDNA探針雜交，選取雜交信號(hào)差異在1.4倍以上陽性克隆12個(gè)測序，獲得了6個(gè)可分析的基因片段，分別與生長、翻譯起始和能量傳遞有關(guān)，其中2個(gè)為編碼未知功能蛋白基因片段，1個(gè)與轉(zhuǎn)化蛋白功能有相似性，但相似性較低。對(duì)已知功能的3個(gè)基因片段設(shè)計(jì)引物，采用熒光定量PCR分析基因表達(dá)差異，其中1個(gè)編碼eIF-4A基因及1個(gè)未知功能的SSH298，與文庫篩選及斑點(diǎn)雜交中得到的信息一致。初步認(rèn)為在赤潮爆發(fā)性生長中eIF-4A基因

4、的表達(dá)量增多，通過影響和加強(qiáng)翻譯的起始，起始或加速了細(xì)胞的快速生長分裂。 在海洋初級(jí)生產(chǎn)中，微型浮游生物是非常重要的貢獻(xiàn)者，因?yàn)樵谒蛑形⑿透∮紊锏姆植济芏葮O大，是浮游植物的主要組成部分，可維持相當(dāng)高程度的生產(chǎn)力。但目前針對(duì)微型浮游生物的分類研究較少，涉及的未認(rèn)定物種較多，沒有統(tǒng)一的分類學(xué)目錄，鑒定較為困難，從而使微型藻的研究進(jìn)展緩慢。 為了豐富微型藻的記錄種類和科研的需要，我們?cè)谶M(jìn)行海洋微型浮游生物調(diào)查的同時(shí)，將

5、固定化樣品經(jīng)一系列處理后，借助掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)原甲藻屬一浮游植物進(jìn)行了觀察描述，藻細(xì)胞呈圓形至橢圓形，長約15-23μm，寬為8-15μm，細(xì)胞表面有數(shù)量豐富的顆粒狀突起，每平方微米有7-10個(gè)顆粒狀突起。藻體的中央有1條片間帶，片間帶寬度大約為0.6-1.5μm之間，有漸狹趨向，最后呈中縫狀。在片間帶之間同樣存在顆粒狀突起。細(xì)胞殼面觀在片間帶上方殼面邊緣有刺絲胞孔，刺絲胞孔周圍分布2-3個(gè)輔助孔。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)該藻細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和

6、原甲藻屬中的微小原甲藻，東海原甲藻雖有相似之處，但在某些基本特征上存在明顯的差異，由于甲藻分類學(xué)尤其是微型藻分類本身存在的局限性，且在采集水樣后，不能立即進(jìn)行大量的生物培養(yǎng)，所以無法進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定命名，我們只將其劃分為原甲藻屬的一未定種Prorocentrum sp. 另外，將未固定的樣品經(jīng)一系列過濾處理后，培養(yǎng)于F/2培養(yǎng)基中，經(jīng)有限稀釋法分離純化到一株微型硅藻，經(jīng)掃描電子顯微鏡及透射顯微鏡下觀察，和Minuto

7、cellus polymorphus極為相似，但形態(tài)上仍有部分差異，后根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中相近物種的18srDNA設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增其18rDNA序列，經(jīng)測序鑒定，與Minutocellus polymorphus的18rDNA部分序列相似度極高，由于18rDNA的高度保守性，其分類階元只能劃分到屬，而種間劃分則需要獲得相關(guān)的5.8SrDNA及ITS序列，但目前尚未有Minutocellus polymorphus相關(guān)區(qū)域序列的報(bào)道，