菌種保藏

1、菌種的保藏菌種是一個國家所擁有的重要生物資源，菌種保藏（preservation）是一項重要的微生物學基礎工作。菌種保藏機構的任務是在廣泛收集實驗室和生產(chǎn)菌種、菌株（包括病毒株甚至動、植物細胞株和質粒等）的基礎上，將它們妥善保藏，使之達到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。為此，在國際上一些工業(yè)較發(fā)達的國家中都設有相應的菌種保藏機構。例如：中國微生物菌種保藏委員會（CCCCM），美國典型菌種保藏中心（ATCC），美國的“北部

2、地區(qū)研究實驗室”（NRRL），荷蘭的霉菌中心保藏所（CBS），英國的國家典型菌種保藏所（NCTC），蘇聯(lián)的全蘇微生物保藏所（UCM）以及日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO）等都是有關國家有代表性的菌種保藏機構。菌種保藏的具體方法很多，原理卻大同小異。首先要挑選典型菌種（typeculture）的優(yōu)良純種，最好采用它們的休眠體（如分生孢子、芽孢等）；其次，還要創(chuàng)造一個適合其長期休眠的環(huán)境條件，諸如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護劑或

3、酸度中和劑等。水分對生化反應和一切生命活動至關重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在保藏中占有首要地位就不言而喻了。五氧化二磷、無水氯化鈣和硅膠是良好的干燥劑，當然，高度真空還可同時達到驅氧和深度干燥的雙重目的。除水分外，低溫乃是保藏中的另一重要條件。微生物生長的溫度低限約在30℃，可是，在水溶液中能進行酶促反應的溫度低限則在140℃左右。這或許就是為什么在有水分的條件下，即使把微生物保藏在較低的溫度下，還是難以較長期地保藏它們的一個主要原

4、因。在低溫保藏中，細胞體積較大者一般要比較小者對低溫更為敏感，而無細胞壁者則比有細胞壁者敏感。其原因同低溫會使細胞內的水分形成冰晶，從而引起細胞結構尤其是細胞膜的損傷有關。如果放到低溫（不是一般冰箱）下進行冷凍時，適當采用速凍的方法，可因產(chǎn)生的冰晶小而可減少對細胞的損傷。當從低溫下移出并開始升溫時，冰晶又會長大，故快速升溫也可減少對細胞的損傷。當然，不同微生物的最適冷凍速度和升溫速度也是不同的。例如，酵母的冷凍速度以每分鐘10℃為宜，而

5、紅細胞則相應地為2000℃。冷凍時的介質對細胞損傷與否也有顯著的影響。例如，0.5mol／L左右的甘油或二甲亞砜可透入細胞，并通過降低強烈的脫水作用而保護細胞；大分子物質如糊精、血清白蛋白、脫脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）雖不能透入細胞，但可能是通過與細胞表面結合的方式而防止細胞膜受凍傷。在實踐中，發(fā)現(xiàn)用較低的溫度進行保藏時效果更為理想，如液氮溫度（195℃）比干冰溫度（70℃）好，70℃又比20℃好，而20℃則比4℃好。一種良好的保

6、藏方法，首先應能保持原菌的優(yōu)良性狀不變，同時還須考慮方法的通用性和操作的簡便性。具體的菌種保藏方法很多，其原理和應用范圍各有側重，優(yōu)缺點也有所差別。在國際著名的美國ATCC（AmericanTypeCultureCollection）中，目前已改為僅采用兩種最有效的方法，即保藏期一般達5～15年的冷凍干燥保藏法和保藏期一般達20年以上的液氮保藏法，以達到最大限度地減少傳代次數(shù)和避免菌種衰退的目的。保藏原理是這樣的：當菌種保藏單位收到合適

7、菌種時，先將原種保藏原理是這樣的：當菌種保藏單位收到合適菌種時，先將原種制成若干液氮保藏管作為保藏菌種，然后再制一批冷凍干燥保藏菌制成若干液氮保藏管作為保藏菌種，然后再制一批冷凍干燥保藏菌種作為分發(fā)用。經(jīng)種作為分發(fā)用。經(jīng)5年后，假定第一代（原種）的冷凍干燥保藏菌年后，假定第一代（原種）的冷凍干燥保藏菌種已分發(fā)完畢，就再打開一瓶液氮保藏原種，這樣下去，至少在種已分發(fā)完畢，就再打開一瓶液氮保藏原種，這樣下去，至少在20多次攪拌，防止局部過堿

8、或過酸而導致測量不準確和營養(yǎng)成分被破壞。1.4加凝固劑配制固體培養(yǎng)基時需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補足所蒸發(fā)水分。1.5過濾分裝在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝。斜面培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養(yǎng)基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。1.6包扎標記將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明