sars病毒m,n,s蛋白的表達和細胞定位

1、北京大學政學者論文集（2003年）SARSCOVMNS蛋白的表達和細胞定位683SarsSars－CovCovM，NSNS蛋白的表達和細胞定位蛋白的表達和細胞定位生命科學學院00級陸文摘要在獲得SarsCov的結構蛋白SMN的cDNA的TEasy克隆之后通過限制性內切酶處理后連接到表達載體上然后通過bactobac桿狀病毒表達系統(tǒng)把結構蛋白的DNA轉座到bac中轉染昆蟲細胞包裝出第一代病毒后用重組病毒感染昆蟲細胞從細胞中純化到Sars

2、Cov的結構蛋白.由于在PCR的設計的引物中在DNA末端加入標記可以利用標記的抗原性用westernblotting檢驗得到的純化蛋白.在昆蟲病毒感染重組病毒48h之后免疫熒光制片觀察蛋白在細胞中的分布.同時將克隆到熒光蛋白載體的MN蛋白和真核表達載體的S蛋白轉染真核細胞通過熒光蛋白的分布或免疫熒光確定MNS蛋白在真核細胞中的分步.關鍵詞：SarsCovSarsCov結構蛋白MNS蛋白轉染westernblotting免疫熒光。前言冠狀

3、病毒科的成員只感染脊椎動物與多種動物和人的疾病有關本科病毒具有胃腸道呼吸道和神經系統(tǒng)嗜性分別引起相應的癥候群.冠狀病毒為多形態(tài)略成球形直徑80160nm.有囊膜.病毒囊膜由雙層脂質組成在脂質雙層中穿插有兩種糖蛋白:膜蛋白(M又稱E1)和纖突蛋白S(又稱E2).囊膜表面覆有長1224nm的突起(即纖突)纖突末端呈球狀由于囊膜纖突規(guī)則的排列呈皇冠狀冠狀病毒的名稱即由此而來.病毒粒子內部為RNA和核衣殼蛋白(N)組成的核蛋白核心呈螺旋式結構直

4、徑916nm.存在于病毒粒子囊膜上的糖蛋白具有不同的功能:M蛋白(2030KD)是一種轉膜糖蛋白它通過3個疏水α螺旋區(qū)3次插入脂質雙層故其大部分(85%)位于囊膜內部僅有N端糖基化的小部分暴露在囊膜的外面.M的功能類似正粘病毒副粘病毒以及彈狀病毒的非糖基化蛋白在病毒裝配期間將核衣殼連接到囊膜上另外抗M抗體在補體存在時可中和病毒感染性.S糖蛋白(180200KD)大部分暴露在脂質層外面是構成囊膜突起的主要成分.它由2個同樣大小的多肽組成S

5、蛋白能直接與宿主細胞表面的受體結合引起細胞融合并具有誘導產生中和抗體和介導細胞免疫等功能.北京大學政學者論文集（2003年）SARSCOVMNS蛋白的表達和細胞定位685圖2Fab示意圖SARS病毒基因組中總共找到了11個編碼序列（CDS，codingsequence）序列比對的結果顯示從第250位核苷酸開始編碼的長度為7074個氨基酸的多肽預測的開放讀碼框1ab多聚蛋白，和鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus，MHV

6、)的相應片斷很相似根據(jù)已有的鼠肝炎病毒相應片斷的知識將預測的開放讀碼框1ab多聚蛋白又分成14個蛋白其中包括依賴RNA的RNA聚合酶.另外一個CDS(開放讀碼框1a多聚蛋白)，就是預測的開放讀碼框1ab多聚蛋白的前4383個氨基酸.其它9個CDS中有4個在BLAST中找到了高度同源的序列分別對應于S蛋白、M蛋白、E蛋白、和N蛋白.5個沒有找到任何同源的序列.所以推定SARS病毒總共有23個蛋白質.N蛋白結合在一個已經確定的病毒RNA包裝

7、的信號上引導螺旋狀排列的核衣殼的裝配.M定位在特殊的細胞質膜泡上面向細胞質的結構上并且可以和E蛋白相互作用幫助核衣殼從膜上出芽.在某些冠狀病毒中M蛋白的C端和核殼體相互作用形成一個核心結構.S蛋白也可以和M相互作用使成熟的病毒粒子以膜泡的形勢釋放出去.S蛋白前體在宿主的細胞質中合成以后會被切成兩個部分S1和S2其中S1形成成熟蛋白的球狀部分具體的切割位點并不清楚.一般情況下冠狀病毒的侵染過程需要宿主細胞膜受體的介導.受體識別位點位于S1

8、的內部.S2形成成熟蛋白的棒狀部分包括一個Nhelix、一個MHelix、一個CHelix和一個跨膜區(qū).S1和S2之間通過分子間作用力相互結合其結合位點可能有多個.S2的跨膜區(qū)把整個Spike蛋白固定在病毒的囊膜上當S1通過受體結合位點和宿主細胞膜受體結合以后會導致S1和S2之間的分子間結合力減弱S1和S2分離.暴露出S2上的3個helixNHelixMHelix和CHelix可以穿過宿主細胞膜使得病毒的囊膜和宿主細胞膜發(fā)生融合.S1和

9、S2之間結合力的強弱是影響冠狀病毒傾染性強弱的重要因素之一.特殊情況下如pH增高的時候S1和S2之間的相互作用被削弱在沒有受體作用的情況S1和S2也能分離S2進一步介導病毒和細胞的融合(Kruegeretal.2000).Spike蛋白的受體屬于一個叫做carcinoembryonicantigencelladhesionmolecules(CEACAMs)的多向性家族(pleiotropicfamily)這是一個包含很廣泛的分子家族在