自養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離、鑒定及norB基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、自養(yǎng)型硝化細(xì)菌是參與生物脫氮過程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影響污水處理系統(tǒng)的硝化效果和生物脫氮效率，是污水生物脫氮的限制性因素。本研究通過富集、分離純化的方式篩選自養(yǎng)硝化細(xì)菌，采用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)手段對其鑒定，找到起硝化作用的norB基因，利用基因工程的手段構(gòu)建高效硝化工程菌，旨在改變自養(yǎng)硝化細(xì)菌生長周期長，脫氮效率低的缺點。
　　 自養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離、鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析：以城市污水處理廠A2/O工藝

2、中好氧活性污泥為菌源，篩選出兩株自養(yǎng)型硝化細(xì)菌N3和N4。轉(zhuǎn)接兩株菌至液體分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天，經(jīng)檢測，兩株菌的硝化效果均可達(dá)100％。通過形態(tài)觀察、生理生化實驗初步鑒定表明，兩株菌屬于硝化桿菌屬。利用分子生物學(xué)手段：DNA提取、PCR擴增、克隆、測序?qū)赀M一步鑒定，測序結(jié)果提交Genbank進行同源性檢索，并通過MEGA軟件進行比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。16S rDNA序列分析表明這兩株菌均屬于硝化桿菌屬，與維氏硝化細(xì)菌的同源性高達(dá)98

3、％。
　　 norB還原酶基因工程菌的構(gòu)建：以N3為出發(fā)菌株，N3的基因組DNA為模板，根據(jù)N3的硝化還原酶norB操縱基因序列和質(zhì)粒載體pET-28a的多克隆位點設(shè)計引物，PCR擴增得到norB基因。之后，經(jīng)過EcoRI、HindⅢ雙酶切，定向克隆到pET-28a載體上，化學(xué)轉(zhuǎn)化至DH5a克隆菌感受態(tài)中，構(gòu)建含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子pET-28a-norB。經(jīng)酶切和測序鑒定，擴增產(chǎn)物的堿基序列與N3中norB操縱基因序列完全吻合。