產(chǎn)PuFAs土壤真菌篩選及EPA基因工程菌構(gòu)建.pdf

1、二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA），一種ω-3系列多不飽和脂肪酸（PuFAs），是人體必須脂肪酸之一，因其具有抗凝血、降血脂、抗炎、抗癌、預(yù)防和治療心血管疾病和糖尿病等重要生理功能而引起廣泛關(guān)注。EPA傳統(tǒng)來源于深海魚油提取，因其受資源緊張、海洋污染等限制而難以滿足市場需求，通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)EPA成為目前的研究熱點(diǎn)。但是，目前微生物發(fā)酵法產(chǎn)EPA的含量仍較低，尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此，選育EPA高產(chǎn)菌株仍

2、是研究重點(diǎn)。本文圍繞選育EPA高產(chǎn)菌株展開，首先從高山寒冷地帶篩選多株P(guān)uFAs生產(chǎn)菌株，同時(shí)克隆EPA油脂合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因MaDGAT，并在建立高山被孢霉遺傳轉(zhuǎn)化方法基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建產(chǎn)EPA的高山被孢霉基因工程菌，取得的主要研究結(jié)果如下：
　?。?）篩選獲得多株P(guān)uFAs生產(chǎn)菌株。從秦嶺、大別山等地取土樣，篩選獲得大量微生物，基于關(guān)鍵酶基因Δ6去飽和酶基因克隆定向初篩多株產(chǎn)PuFAs菌株，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測Pu

3、FAs生產(chǎn)菌株的脂肪酸組成成分，其中，7株菌可以合成花生四烯酸（ARA），ITS序列鑒定這些微生物主要為被孢霉屬真菌，未篩選獲得可以合成EPA的菌株。
　?。?）克隆獲得微生物油脂合成關(guān)鍵酶基因MaDGAT，并在釀酒酵母中進(jìn)行了功能驗(yàn)證。首先，利用RT-PCR的方法從高山被孢霉菌株中成功克隆獲得油脂合成關(guān)鍵酶基因MaDGAT；其次，構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pYES2-MaDGAT，并轉(zhuǎn)化甘油三酯（TAG）合成缺陷的釀酒酵母H1246進(jìn)行

4、功能驗(yàn)證，結(jié)果表明，MaDGAT基因在酵母中成功表達(dá)，使H1246菌株恢復(fù)了TAG合成和積累能力，熒光顯微鏡觀察顯示，酵母中重新出現(xiàn)了脂質(zhì)顆粒，同時(shí)，酵母菌體油脂含量提高了35.6％。
　?。?）建立了高山被孢霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，并構(gòu)建了產(chǎn)EPA的高山被孢霉基因工程菌。首先，建立了以紅色熒光蛋白為篩選標(biāo)記，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高山被孢霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，即農(nóng)桿菌濃度達(dá)到OD600為0.8，與106個(gè)/mL的高山被孢霉孢子懸液等體積混合，添加乙酰丁

5、香酮至終濃度為150μg/mL，于24°C，200rpm共培養(yǎng)48h，之后涂布含烯草酮72μg/mL的PDA平板，培養(yǎng)4-6天觀察紅色熒光篩選陽性轉(zhuǎn)化子；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了含MaDGAT基因和Δ17去飽和酶基因的表達(dá)載體pCAMBIA1303-DsRed-MaDGAT-D17，并成功轉(zhuǎn)化高山被孢霉，獲得5株產(chǎn)EPA的基因工程菌，其中產(chǎn)量最高的菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，EPA占總油脂比例為10.5%，產(chǎn)量為0.91g/L。
　　以上研究